阿尔茨海默病中相异协同转录因子导致的神经元雄激素受体信号失调

《iScience》：Dysregulation of neuronal androgen receptor signaling by divergent collaborative transcription factors in Alzheimer’s disease

　　

要点•GATA3作为表观遗传修饰因子，特异性地定义神经元的AR顺式组•AR结合位点富集于调控关键基因的神经元超级增强子中•AR结合信号随阿尔茨海默病进展而下降•AR复合物中的转录因子在衰老和痴呆过程中失调摘要关于雄激素及雄激素受体（AR）如何通过转录机制对人体组织发挥特异性作用，目前仍不清楚。在本研究中，我们证明了神经元细胞特异性转录因子（TFs）可能作为表观遗传修饰因子发挥重要作用，塑造神经元活动期间的AR顺式组。GATA3与人神经元细胞模型中特异性调控序列的结合与AR介导的转录增强相关。AR结合位点（ARBSs）富集于编码关键神经元因子的超级增强子（SEs）重叠区域。此外，AR信号在老年男性大脑中的作用表明其支持神经功能，并在阿尔茨海默病（AD）进展过程中下降。AR相关转录因子的表达水平在衰老和AD发展过程中失调。转录因子的表达改变可能有助于AR信号的破坏。因此，协作转录因子可能参与神经元雄激素反应以及衰老和痴呆进展中的表观遗传调控。图解摘要引言转录因子（TFs）通过结合特异性基因组位点驱动基因表达变化和染色质重组。TFs和信号因子在生理过程的调控中发挥基本作用。谱系和细胞类型特异性的主控转录因子通过建立细胞类型特异性增强子来调控基因表达。选择结合位点的过程对于大多数TFs的功能至关重要。信号因子将胞外信号传递至这些增强子并影响TFs的功能和表观遗传修饰。细胞身份在产前由组蛋白H3K27乙酰化富集的超级增强子（SEs）建立和维持。SEs与细胞类型特异性TFs的功能相关；因此，鉴定主控TFs对于理解细胞状态的转录调控和程序化细胞信号传导具有重要意义。然而，TFs被特异性招募至这些增强子位点的机制尚不完全清楚。类固醇激素受体在其激素配体的存在下与DNA结合。雄激素及其受体——雄激素受体（AR）——影响多种细胞类型的基因调控。雄激素主要通过促进细胞增殖和分化来驱动男性生殖系统的发育和维持。此外，雄激素在维持肌肉骨骼、心血管、免疫和中枢神经系统的功能方面也发挥生理作用。因此，男性因衰老导致的雄激素下降会导致老年疾病，如骨质疏松症或痴呆症。性激素缺乏对老年人的骨骼稳态和认知功能有严重的有害影响。在小鼠中，雄激素补充增加了骨小梁数量、宽度、体积和骨矿物密度。AR通过调节成骨细胞成熟在雌雄小鼠的骨骼代谢中均发挥显著作用。值得注意的是，临床证据表明前列腺癌治疗中的雄激素剥夺会抑制认知功能。接受雄激素剥夺治疗的男性前列腺癌患者痴呆和阿尔茨海默病（AD）的发生率更高。雄激素在巨噬细胞吞噬作用、清除Aβ沉积、增强突触可塑性和抑制炎症反应方面发挥作用。在大鼠AD模型中，雄激素通过清除自由基、增强突触可塑性和调节神经元生物能量功能来预防认知功能下降。然而，AR信号如何保护人类大脑中的这些神经元功能仍不清楚。AR的基本功能是通过与核心调节蛋白和转录机制形成复合物来驱动激素特异性转录程序。与雄激素刺激后的差异性结果一致，AR结合在细胞类型和组织之间表现出显著差异。先前的研究通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）绘制了雄激素响应的人类前列腺癌细胞中的AR结合位点（ARBSs）。AR阳性前列腺癌根据疾病阶段和AR表达水平表现出差异化的AR结合模式。叉头框蛋白A1（FOXA1）作为乳腺和前列腺癌细胞中的先导因子，在激素处理前结合许多雌激素受体（ER）结合位点和ARBSs，为核受体结合准备开放的染色质。染色质可及性在决定核受体结合位点中的预测能力可能在于鉴定由FOXA1等先导转录因子结合的区域。AR与细胞类型特异性SEs相互作用，后者由依赖液-液相分离（LLPS）的主控TFs形成，以驱动前列腺癌进展。因此，了解AR在其他情况下如何选择结合位点对于确定ARBSs的完整谱系至关重要。验证AR在其他组织中以谱系特异性方式参与SE发育的功能特异性信息，以及AR活性随衰老或疾病进展变化的信息仍然缺乏。为深入了解细胞类型特异性ARBS选择的基础机制，我们首先全面研究了人类神经元细胞模型——表达AR的神经母细胞瘤衍生SH-SY5Y细胞中的ARBSs。我们证明了神经元细胞特异性ARBSs通过与细胞类型特异性转录因子GATA3协作表现出转录程序，并激活组蛋白修饰模式导致SE形成。也就是说，AR和GATA3增强了神经元细胞分化的转录激活。我们进一步关注人类男性大脑组织中AR信号及其结合伙伴在年龄相关疾病AD发展过程中的变化。因此，细胞类型特异性或组织特异性转录因子复合物主导了衰老和疾病进展中涉及的雄激素反应和表观遗传调控。结果神经元AR通过与GATA3协作调控神经元活动相关因子由于神经元是雄激素的重要靶细胞，我们研究了人类神经元细胞模型——神经母细胞瘤衍生SH-SY5Y细胞中的AR转录程序。SH-SY5Y细胞系是神经科学研究中广泛使用的模型，包括AD研究。AR蛋白表达和雄激素介导的细胞增殖也在此细胞模型中观察到。然后我们进行了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析，以鉴定稳定过表达AR的SH-SY5Y细胞（SH-SY5Y-AR）和具有内源性AR表达的控制细胞中的AR结合位点（ARBSs）（图S1A和S1B）。二氢睾酮（DHT）雄激素处理和AR过表达增加了结合峰的数量（图1A）。有趣的是，SH-SY5Y中与内源性ARBSs最接近的基因与基因本体（GO）术语相关，如轴突发生、前脑发育和突触组织（图1B）。一致的是，微阵列分析显示雄激素处理与神经系统和突触功能相关基因相关（图1C和S1C–S1F），表明AR可能调控这些神经元相关基因。图1 人类神经元细胞模型通过与GATA3的协作拥有组织特异性AR信号显示完整标题(A) 人类神经元细胞模型中ARBSs的鉴定。人类神经母细胞瘤衍生细胞系SH-SY5Y和过表达AR的SH-SY5Y（SH-SY5Y-AR#1和AR#2），用溶剂或10 nM二氢睾酮（DHT）处理24小时。展示了获得的ARBSs数量（P < 1E?4, FDR <0.01）和ARBSs的重叠情况。(B) SH-SY5Y细胞中与AR结合相关的基因的GO术语分析。(C) 显示AR调控的代表性基因的堆叠图。AR结合基因是与SH-SY5Y细胞中ARBSs最接近的基因。(D) AR峰位（±50 bp）的基序发现分析。HOMER鉴定的SH-SY5Y-AR #1和#2细胞ARBSs中重叠的AR结合峰周围最显著的AR结合基序及p值。(E) SH-SY5Y（Vec）和SH-SY5Y-AR #1（AR O/E）细胞中GATA3与AR的共免疫沉淀。细胞用溶剂或DHT（10 nM）处理24小时。全细胞裂解物用GATA3抗体进行免疫沉淀，然后用所示抗体进行印迹。IgG作为阴性对照。(F) 转入U2OS细胞的Venus-AR和mCherry-GATA3的免疫荧光（IF）图像。比例尺，10 μm。(G) 显示SH-SY5Y-AR #1细胞中GATA3结合信号强度的堆叠图。显示了显著AR峰周围的GATA3峰强度。(H) SH-SY5Y-AR #1细胞中AR峰位周围的GATA3 ChIP-seq信号组成图。另见图S1。基序发现分析显示GATA家族（GATA3、GATA4和GATA6）结合基序在AR结合峰中显著富集（图1D；图S1G）。有趣的是，只有GATA3在人类脑类器官中的一部分神经元细胞中与开放染色质区域相关。微阵列数据显示，在GATA家族的三个亚型中，GATA3在此细胞模型中表现出最高的表达水平（图S1H）。GATA3与AR在蛋白水平的相互作用通过免疫沉淀后接western blot（图1E和S1I）及免疫荧光（IF）分析（图1F）得到了验证。ChIP-seq实验显示GATA3结合信号在AR结合的峰区域富集，表明GATA3与AR在SH-SY5Y-AR细胞中具有协同作用（图1G和1H）。在内源性SH-SY5Y细胞中也观察到类似结果（图S1J）。使用公共微阵列数据观察到人类大脑组织中AR和GATA3表达的正相关（图S1K）。总之，这些结果提供了证据表明AR/GATA3复合物可能对人类神经元细胞模型中的雄激素依赖性基因激活很重要。细胞特异性协作因子对于促进雄激素介导的基因调控和细胞分化是必需的接下来，我们检查了GATA3是否为雄激素对神经元细胞特异性基因调控所必需。AR协作转录因子GATA3的结合位点富集于代表增强子活性的组蛋白H3K27乙酰化（AcH3K27）区域，并在SH-SY5Y细胞中与ARBSs重叠，参与与神经元分化相关的靶基因激活，包括核因子I/X（NFIX）（图2A）。值得注意的是，我们发现GATA3敲低抑制了神经母细胞瘤衍生的SH-SY5Y和Kelly细胞中AR蛋白的表达（图2B和S2A）。qRT-PCR分析表明，GATA3敲低显著抑制了这两种模型细胞中雄激素介导的基因诱导（图2C和S2B）。然而，AR过表达挽救了GATA3敲低引起的AR蛋白水平降低。GATA3敲低也抑制了AR过表达细胞中雄激素依赖性基因诱导，表明GATA3不仅有助于维持AR蛋白水平，还有助于促进AR功能（图S2C和S2D）。图2 AR协作因子对于AR靶基因的细胞特异性调控是必需的显示完整标题(A) SH-SY5Y和SH-SY5Y-AR细胞中AR调控基因周围的代表性ChIP-seq轨道。方框标示了GATA3与AR共占区域。(B) 用siGATA3 #1、#2或siControl（10 nM）处理的SH-SY5Y细胞中AR和GATA3的免疫印迹。细胞用溶剂或10 nM DHT处理24小时。β-actin作为上样对照。(C) 用siGATA3 #1、#2或siControl（10 nM）处理的SH-SY5Y细胞中AR调控基因的qRT-PCR分析表达量。细胞用溶剂或10 nM DHT处理24小时。数据相对于siControl转染和溶剂处理细胞报告（数据以mean ± SD表示，N = 3，技术重复）。进行双因素ANOVA后接Dunnett事后检验。?:p < 0.05, ??:p < 0.01, ???:p < 0.001 vs. siControl。实验独立重复两次，结果一致。(D) SH-SY5Y细胞转入包含细胞类型特异性AR结合增强子区域的荧光素酶载体。孵育24小时后，细胞用溶剂或10 nM DHT处理24小时。然后测量荧光素酶活性（数据以mean ± SD表示，N = 3，生物学重复）。进行双侧Student's t检验。?:p < 0.05和??:p < 0.01 vs. 溶剂。(E) 包含野生型（WT）GATA3基序或突变（Mut）的HAND2增强子荧光素酶载体示意图。（下方）SH-SY5Y细胞转入包含HAND2增强子区域（WT或Mut）的荧光素酶载体。孵育24小时后，细胞用溶剂或10 nM DHT处理24小时。然后测量荧光素酶活性（数据以mean ± SD表示，N = 3，生物学重复）。进行双侧Student's t检验。N.S: 无显著差异。(F) 过表达AR的SH-SY5Y细胞（SH-SY5Y-AR #1）或载体对照（Vec#1）的显微镜图像。细胞用siGATA3 #1或siControl（10 nM）处理，如所示。细胞用溶剂或0.1 nM DHT孵育5天。比例尺，10 μm。(G) 过表达AR的SH-SY5Y细胞（SH-SY5Y-AR #1）或载体对照（Vec#1）中突起长度的定量（N = 10，生物学重复）。细胞用siGATA3 #1、#2或siControl（10 nM）处理，如所示。细胞用溶剂或0.1 nM DHT孵育5天。

采用单向方差分析（One-way ANOVA）和Tukey事后检验以获得p值。数据以均值±标准差表示，?：p < 0.05，??：p < 0.01，???：p < 0.001。

(H) SH-SY5Y过表达AR细胞或空载体对照（#1和#2）中AR、GATA3和NeuN的免疫印迹检测。以β-actin作为上样对照。按指示用siGATA3 #1、#2或siControl（10 nM）处理细胞，并与溶剂或0.1 nM DHT共孵育5天。

(I) SH-SY5Y过表达AR或空载体对照（#1和#2）细胞中NeuN蛋白表达的定量分析（N = 5，生物学重复）。以β-actin作为上样对照进行蛋白表达的标准化。采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）获得Vec与AR之间的p值。采用非配对双侧Student's t检验获得DHT ?和+之间的p值。数据以均值±标准差表示。

参见图S2。

我们构建了含有通过ChIP-seq在SH-SY5Y神经细胞模型中鉴定的ARBS序列的报告基因质粒。有趣的是，在转染含有神经细胞类型特异性ARBS的质粒的细胞中，观察到报告基因活性的显著上调（图2D）。我们观察到，当GATA3的结合基序序列发生突变时，心脏和神经嵴衍生蛋白2（HAND2）-LUC的激活受到抑制，表明GATA3结合对AR介导的神经细胞转录激活具有重要意义（图2E）。

接下来，我们研究了这些转录因子在雄激素和AR介导的神经细胞分化中的作用。我们通过在含有视黄酸（RA）的培养基中培养细胞，将SH-SY5Y神经细胞模型从最初的类上皮细胞表型分化为更具扩展性和分支的神经元表型。值得注意的是，我们发现敲低GATA3减少了具有分支表型、表现为明显神经突起的细胞数量（图2F）。雄激素处理或AR过表达显著促进了细胞分化试验中神经突起的长度，而GATA3敲低则抑制了这一过程（图2G）。此外，代表性神经元标志物NeuN的表达被雄激素处理和AR过表达所增加（图2H和2I）。这种上调作用被GATA3敲低所减弱，表明GATA3可能参与雄激素介导的神经元分化（图2I）。

ChIP-seq分析揭示了SH-SY5Y细胞中ARBSs处AcH3K27的峰强度（图3A和3B）。此外，基于AcH3K27 ChIP-seq富集程度，使用ROSE（超级增强子排名工具）对增强子进行排名，确定了SH-SY5Y细胞中的超级增强子（SE）区域（图3C）。这些SE区域包括与神经元分化和突触功能相关的重要基因，如雌激素相关受体γ（ERR γ），该受体是AD的重要标志物，正如我们此前报告的那样。我们还观察到ARBSs与SE区域之间存在重叠，在SH-SY5Y-AR细胞中，大多数SE区域与ARBSs重叠（图3D）。值得注意的是，与轴突形成相关的基因在AR调控的基因中呈富集状态（图3E、3F、S3A和S3B）。例如，Krüppel样因子7（KLF7）和神经丝轻链（NEFL）促进皮层神经元中轴突的生长。我们还注意到，这些AR相关的超级增强子基因包括与神经元相关的转录因子，如NFIX和HAND2（图3F和S3C）。NFIX神经元通过释放γ-氨基丁酸（GABA）提供区域抑制作用，而抑制性神经元调节性别典型行为，控制情境依赖性的行为状态。HAND2对神经发生和神经递质指定至关重要。我们在HAND2基因座附近鉴定到一个超级增强子区域与AR和GATA3结合位点重叠（图S3D）。我们推测，AR介导的这些神经元相关转录因子的调控可能有助于激活神经元的转录网络。这些观察结果与我们在前列腺癌中所证明的AR可以通过细胞类型特异性或疾病特异性方式为基因调控贡献超级增强子活性的概念一致。

**图3 超级增强子基因具有神经元细胞特异性并受AR结合调控**

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(A) 热图显示SH-SY5Y细胞中组蛋白修饰AcH3K27的信号强度。显著AR峰周围AcH3K27的阴影深度反映峰强度。

(B) SH-SY5Y细胞和SH-SY5Y-AR #1细胞中AR结合峰周围AcH3K27 ChIP-seq信号的组成图。

(C) 人神经细胞模型中超级增强子的鉴定。对SH-SY5Y细胞和SH-SY5Y-AR #1细胞中AcH3K27 ChIP-seq信号进行ROSE分析。

(D) 显示SH-SY5Y细胞和SH-SY5Y-AR #1细胞中获得并与ARBSs重叠的超级增强子数量。

(E) 对SH-SY5Y-AR #1细胞中与ARBSs重叠并被AR诱导的超级增强子最近邻基因进行GO术语分析。

(F) 热图显示受AR调控的代表性超级增强子基因。SH-SY5Y细胞中与超级增强子相关的AR结合基因为距结合位点最近的基因。通过微阵列分析筛选被AR过表达诱导的基因（倍变>1.2）。

参见图S3。

**人类脑组织在衰老和AD进展过程中AR结合及协同转录因子表达的变化**

为了将我们在模型细胞中关于协同AR互作转录因子的研究结果进行拓展，我们研究了这些转录因子的表达变化是否与衰老和老年疾病（如阿尔茨海默病，AD）相关。我们使用了三个队列的转录组数据集来分析人脑中的年龄相关基因表达谱（GSE48350和GSE15222）。随后我们观察到，在人脑组织中，GATA3和GATA4的表达随衰老而降低（图4A和S4A）。有趣的是，GATA3和GATA4的表达在AD样本中降低（图4B和S4B）。我们通过qRT-PCR在临床样本中证明了与对照组相比，AD患者大脑中GATA3的下调（图4C）。总体而言，这些发现表明，在人组织中，这些转录因子的异常表达可能发生在衰老和老年疾病（包括AD）的发展过程中。

**图4 人脑组织中AR协同转录因子的表达随衰老和AD进展的变化**

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(A) GATA3表达水平随衰老的变化。使用人脑mRNA表达的微阵列数据（GSE48350）。人脑（N = 142）中GATA3表达与年龄（20–90岁）的Pearson相关分析。

(B) AD患者（N = 176）或对照（非AD）（N = 187）人脑中GATA3的表达水平。使用微阵列数据（GSE15222）。采用Mann-Whitney U检验获得p值。数据以均值±标准差表示。

(C) 我们的队列中AD患者（N = 8）或对照（非AD）（N = 10，生物学重复临床样本）人脑中GATA3的表达水平。我们进行qRT-PCR分析以测量mRNA表达水平。采用Mann-Whitney U检验获得p值。数据以均值±标准差表示。

(D) AD患者（男性，年龄80至86岁）脑组织中磷酸化TAU蛋白（pTAU）的免疫组织化学染色。比例尺，100 μm。

(E) 通过ChIP-seq在AD和对照（非AD）患者脑组织中获得的AR结合位点（ARBSs）数量。使用针对AR N端和C端结构域的不同抗体进行的两项研究中重叠的ARBSs（P < 1e?4，FDR < 0.01）如图所示。

(F) AR峰位置（±50 bp）的基序发现分析。通过HOMER分析鉴定的对照（Ct1）脑组织中代表性的显著AR结合基序及其p值。

(G) AD患者（N = 176）或对照（非AD）（N = 187）人脑中Fra-1的表达水平。使用微阵列数据（GSE15222）。采用Mann-Whitney U检验获得p值。数据以均值±标准差表示。

(H) 我们的队列中AD患者（N = 8）或对照（非AD）（N = 10，生物学重复临床样本）人脑中Fra-1的表达水平。我们进行qRT-PCR分析以测量mRNA表达水平。采用Mann-Whitney U检验获得p值。数据以均值±标准差表示。

(I) 代表性免疫印迹图像显示Fra-1、GATA2/3和pTAU（AT8）的表达。采用AD和非AD对照者（N = 5）的颞叶人脑组织进行Western blot分析。以β-actin作为上样对照。

(J) 对照（Ct1）脑组织中AR及其相关因子ChIP-seq信号的组成图。

(K) 热图显示对照（Ct1）脑组织中AR、其相关因子（Fra-1、GATA3、NRF1和SP1）以及组蛋白H3K27乙酰化（AcH3K27）的ChIP-seq结合信号强度。

参见图S4。

为了进一步探索AR信号在体内衰老相关疾病发展过程中是如何在人体组织中受到调控的，我们通过ChIP-seq绘制了五名男性患者脑组织中AR的全基因组占据图谱，其中包括三名AD患者（AD1–3：临床痴呆评分（CDR）为2–3，具有显著的AD病理改变）和两名非AD对照患者（Ct1、Ct2：CDR为0–0.5，无或极轻微AD病理改变）。我们使用颞叶组织的灰质来分析AR活性，主要在神经元中分析。在三名AD脑组织样本中，AD1和AD3中磷酸化tau（pTAU）蛋白沉积显著，表明存在与AD相关的晚期病理改变（图4D）。相比之下，AD2脑标本中pTAU信号染色较弱，提示为伴有低神经纤维缠结（NFT）评分和临床痴呆状态的AD中度阶段（表S1）。AR ChIP-seq研究使用了两种针对AR N端和C端结构域的AR特异性抗体（图S5A）。两种结果之间重叠的ARBSs在对照组和AD2中包含数千个ARBSs，而AD1和AD3中的ARBSs数量极低（图4E）。对对照组中ARBSs底层基因组序列的基序分析揭示了AR结合基序和bZip型转录因子（如AP-1家族基序）的显著富集（图4F和S4C）。有趣的是，AP-1家族因子如Fra-1随衰老而上调（图S4D）。此外，AD患者脑中的Fra-1表达水平高于对照组（图4G）。我们通过qRT-PCR在临床样本中证明了与对照组相比，AD患者大脑中Fra-1的上调（图4H），以及通过Western blot分析（图4I和S4E）验证。有趣的是，其他神经元相关转录因子，如核呼吸因子1（NRF1）和特异性蛋白1（SP1），其结合基序在AR结合峰中呈显著富集状态，展示了另一种在人体内定义AR信号的机制。转录组数据集揭示，NRF1表达水平与年龄之间存在正相关（图S4D）。同时，我们注意到SP1表达水平在AD患者脑中高于对照组（图S4F），表明这些转录因子在人脑中的表达变化依赖于衰老和AD的发展。我们证明了Fra-1（图S4G）和NRF1（图S4H）在脑组织中与AR的互作，表明这些转录因子在体内调控AR功能中的作用。为了进一步研究细胞系与脑组织之间基序分析结果差异的原因，我们检测了候选转录因子的表达。GATA3在颞叶组织中的表达低于SH-SY5Y细胞，而NRF1表达水平相当（图S4I）。由于GATA3的表达因脑区域不同而变化（根据公共脑RNA-seq数据库，图S4J），AR与其他转录因子之间的互作可能因组织环境和这些转录因子的表达水平不同而有所差异。

随后，我们通过ChIP-seq研究了这些转录因子是否被募集到ARBSs上（图4J和4K）。通过ChIP-seq在对照脑中观察到NRF1和SP1在AR结合峰周围富集，提示AR通过这些神经元相关转录因子与DNA结合。在ARBSs中心也观察到GATA3和Fra-1的富集，提示这些转录因子有助于在体内调控AR活性。我们进一步通过分析对照和AD脑组织中的AcH3K27，研究了这些ARBSs是否与活跃转录相关（图5A和5B）。对照组和AD2中AR结合峰周围AcH3K27 ChIP-seq信号较高，证明ARBSs在体内具有激活的增强子/启动子功能（图5B）。此外，由于Fra-1在AD组织中的表达高于对照组织（图4I），我们在对照和AD脑组织中进行了Fra-1 ChIP-seq研究，以探索AR协同转录因子在AD脑中如何与AR关联。我们发现AD2组织中Fra-1结合信号远高于对照组织（图5B）。相反，在AD1和AD3中，AR峰周围Fra-1和AcH3K27结合信号的富集受到抑制（图5B）。

这些结果提供了大脑中ARBSs功能性激活的证据，即使在衰老男性或中度阿尔茨海默病（AD）大脑组织中也是如此。然而，在晚期AD大脑中，AR结合事件及随后的转录激活受到抑制。

图5 疾病进展过程中衰老男性ARBSs上分歧的转录复合物

(A) LRRC45和USP5两个AR结合基因的代表性基因组浏览器轨道。显示了对照组衰老男性（Ct1）大脑组织中AR及其相关因子（NRF1、SP1、Fra-1和GATA3）以及组蛋白H3K27乙酰化（AcH3K27）的ChIP-seq富集概况。
(B) Ct1、AD2和AD3大脑组织中ARBSs中心周围AR、Fra-1和AcH3K27的ChIP-seq信号组成图。
(C) 对照大脑组织中ARBSs（AR-N）的重叠情况。韦恩图显示Ct1和Ct2大脑组织中ARBSs的重叠。标注了观察重叠与随机预期重叠的比值。
(D) 热图展示了Ct1和Ct2大脑组织中AR结合信号强度的富集情况。展示了使用两种分别靶向N端（N）或C端（C）的AR抗体的实验结果。
(E) Ct1和Ct2大脑组织中AR ChIP-seq信号的组成图。
(F) 热图展示AR结合信号强度的富集情况。韦恩图显示Ct1和AD1大脑组织中ARBSs（AR-N）的重叠情况。
(G) 显示了指定ARBSs中心周围AR ChIP-seq信号的组成图。
另见图S5。

在AD大脑中发现了分歧的AR结合事件

我们发现，两个Ct样本的AR结合图谱与随机预期相比显示出足够的重叠（图5C和S5B），这支持了AR结合信号在非AD衰老男性大脑组织中可重复性检测的观点（图5C–5E和S5C）。随后我们比较了Ct组织和AD组织之间的ARBSs，以研究AR信号传导是否因AD进展而发生改变（图5F、5G和S5D–S5F）。AD1与Ct1中ARBSs的比较显示，Ct1和AD1之间仅有少部分ARBSs存在重叠（图5F）。在Ct1特异性ARBSs处的AR结合信号在所有大脑样本中均被检测到；然而，这些信号在AD1和AD3中减少。相反，AD1和AD3特异性ARBSs被识别在AR结合信号在其他样本中显著降低的区域（图5G、S5E和S5F），表明晚期AD与对照大脑组织之间的AR结合图谱存在分歧。

通路分析显示，在Ct和AD2大脑中发现的AR结合基因富集了与信号转导（如PI3K和AMPK）、蛋白质/RNA修饰以及神经退行性疾病相关的基因，表明AR在体内维持大脑功能方面发挥作用（图6A）。然而，这些基因的富集在AD1和AD3中减弱。对照大脑组织中ARBSs的全基因组分析显示在启动子和内含子区域的富集度更高，而AD1和AD3中则显示出向基因间区域结合增多的转变（图S6A）。此外，基于AcH3K27 ChIP-seq数据，确定了人类大脑组织中的启动子区域（SE）。重要的是，在脑中确定的大多数SE区域与AR结合区域重叠，揭示了AR在调节大脑功能方面的重要性（图6B）。与SH-SY5Y细胞的结果类似，在SE区域中受AR调控的基因中，与转录和轴突导向相关的基因得到了富集（图S6B和S6C）。因此，AR顺式作用元件组调控的转录程序在晚期AD大脑中可能受到破坏。

图6 炎症反应是AD进展过程中AR顺式作用元件组破坏的关键信号通路

(A) 大脑组织中ARBSs最近基因的GO术语和KEGG通路分析。
(B) 对照大脑组织（Ct1、Ct2）中确定的SE数量及其与ARBSs（AR-N）的重叠情况。
(C) AD与对照大脑组织相比上调基因的GO术语分析。
(D) AR峰值位置（±50 bp）的motif发现分析。显示了HOMER在AD1和AD3大脑组织中识别的代表性显著AR结合motif及p值。
(E) 对AD和非AD对照的时间人类大脑组织进行了Western blot分析（N = 3）。上部：显示STAT3/5和AR表达的免疫印迹图像，β-actin用作上样对照。下部：各条带强度的定量结果。数据以均值±标准差表示。（N = 3，生物学重复）。p值通过双尾Student's t检验计算。N.S：无统计学意义。
(F) 大脑组织中AR免疫沉淀及AR、SP1和STAT3/5的Western blot分析。显示AR-IP相对于IgG-IP的条带强度比率定量。
(G) 图S6F中识别的AD下调基因（校正p < 0.05，Log2 Fold > 1）在AR、AR/GATA3及AR/Fra-1结合基因中的百分比。基因比例通过卡方检验与背景（所有基因）进行比较。
(H) KEGG通路分析确定的AD相关基因与AD相比对照大脑组织中下调基因（校正p < 0.05，Log2 Fold > 1）的韦恩图。显示了重叠基因的功能和基因名称。
(I) 对照和AD大脑组织中蛋白酶体相关（PSMA1）和线粒体相关（NDUFA3）基因中AR结合信号的代表性示例。
(J) AR靶基因在AD中相比对照下调的RNA-seq数据示例。使用每千碱基外显子每百万比对读数的片段数（FPKM）值作为RNA-seq的表达水平。数据以均值±标准差表示。（N = 3，生物学重复）。P值由DESeq2确定。
另见图S6。

人类大脑组织中协作性转录因子表达失调和AR顺式作用元件组破坏促进AD进展

此外，我们对Ct和AD患者的6份大脑组织进行了RNA测序（RNA-seq），以分析Ct（N = 3）和AD（N = 3）大脑之间的差异表达基因（DEGs）（图S6D）。我们观察到AD中NeuN表达没有显著下降，表明组间神经元细胞群具有可比性。值得注意的是，在AD组织与Ct组织相比下调的基因（原始p < 0.05，Log2FC < ?1）中，我们观察到与神经退行性疾病和神经元活动相关的基因富集，证实了涉及AD进展的基因特征谱（图S6E）。在添加一个额外对照样本并应用严格的Benjamini-Hochberg校正p < 0.05阈值后，我们同样观察到下调基因中富集了类似通路（图S6F）。接下来，我们探索了AD组织中AR信号传导破坏性变化背后的潜在机制。重要的是，包括STAT3在内的炎症反应基因在AD与Ct大脑组织相比上调的基因（原始p < 0.05，Log2FC > 1）中最为显著富集（图6C）。在严格阈值（Benjamini-Hochberg校正p < 0.05）确定的上调基因中也富集了类似通路（图S6F）。AD1和AD3特异性AR结合峰值的motif分析显示信号转导与转录激活（STAT）家族结合motif富集（图6D），表明晚期AD大脑组织中的ARBSs因大脑中转录因子复合物形成变化而发生改变。事实上，STAT3和STAT5蛋白的表达水平在AD中相比Ct组织有所升高（图6E），这提出了与炎症反应相关的上调转录因子可能有助于破坏AR结合图谱并导致分歧的大脑AR信号的可能性。免疫沉淀后进行Western blot分析显示，与Ct相比，STAT3/5与AR在AD大脑中的相互作用增强（图6F）。

为了确定可能通过功能贡献预防AD进展的AR调控基因，我们将这些转录概况与AR结合数据进行整合。值得注意的是，我们发现AR结合基因、AR/GATA3结合基因和AR/Fra-1结合基因在AD大脑组织中的下调基因（校正p < 0.05，Log2FC < ?1）中显著富集（图6G）。使用公共RNA-seq数据集的分析中也观察到类似趋势（校正p < 0.01，Log2FC < ?0.5和?0.2），支持了AR结合信号可能在预防AD进展中发挥重要作用的观点（图S6G）。随后我们专注于通过KEGG通路分析确定的AD相关基因。与AD大脑组织中下调基因重叠的AR结合基因与线粒体ATP合成或蛋白酶体基因相关，这些是预防AD的重要通路（图6H–6J）。在启动子区域周围，Ct大脑中观察到AR结合的富集，但在AD中则减少（图6I）。总之，这些发现表明AR结合事件的破坏以及随后的基因表达程序对AD进展具有重要意义。

衰老导致不同的AR相关转录因子表达增加，抑制神经元AR信号传导和细胞身份

为了研究改变的AR结合转录因子是否能调节表观遗传状态和AR招募以调控基因表达，我们使用ChIP-seq解析了过表达Fra-1的SH-SY5Y细胞（SH-SY5Y-Fra-1）和对照细胞（SH-SY5Y-Vec）中ARBSs及AcH3K27修饰的全基因组图谱。Fra-1结合信号在AR结合峰值周围在Fra-1细胞中增强（图7A）。尽管SH-SY5Y-Fra-1细胞中Fra-1结合位点与Vec细胞中ARBSs的重叠很少，但SH-SY5Y-Fra-1细胞中一半的ARBSs与显著Fra-1结合位点重叠，表明AR结合区域根据Fra-1表达水平发生了变化（图7B和7C）。值得注意的是，虽然在SH-SY5Y-Vec细胞中GATA3结合motif在ARBSs中心最为显著富集，但在SH-SY5Y-Fra-1细胞的ARBSs中，Fra-1结合motif被确定为最显著富集的顶级转录因子motif（图S7A）。

图7 在SH-SY5Y神经元模型细胞中强制表达改变的转录因子Fra-1破坏了细胞身份和神经元AR信号传导

(A) Fra-1 ChIP-seq峰值相对于AR峰值位置的分布情况。在过表达Fra-1（Fra-1）或对照（Vec）的SH-SY5Y细胞中进行了Fra-1和AR ChIP-seq。细胞用10 nM DHT处理24小时。
(B) 热图显示显著ARBSs周围Fra-1信号强度。韦恩图显示SH-SY5Y-Fra-1细胞中Fra-1结合位点（P < 1E?4，FDR < 0.01）与SH-SY5Y-Fra-1和Vec细胞中ARBSs（P < 1E?4，FDR < 0.01）的重叠情况。
(C) 热图显示SH-SY5Y-Fra-1和Vec细胞中AR、AcH3K27以及SH-SY5Y-Fra-1细胞中Fra-1的ChIP-seq信号强度在显著ARBSs周围的变化。
(D) SH-SY5Y-Fra-1细胞中包含高Fra-1信号的ARBSs与Vec细胞中AcH3K27位点的重叠情况。重叠区域被定义为"Vec中高AcH3K27"，非重叠区域被定义为"Vec中低AcH3K27"。
(E) SH-SY5Y-Fra-1细胞中与"Vec中高AcH3K27"且具有高Fra-1信号的ARBSs相关的AcH3K27 ChIP-seq峰值分布。
(F) SH-SY5Y-Fra-1和Vec细胞在分化培养基中孵育5天后的鬼笔环肽和NeuN表达免疫荧光图像。比例尺，10 μm。
(G) SH-SY5Y-Fra-1和Vec细胞中GATA3、Fra-1和NeuN的免疫印迹。细胞在指定时间段后于分化培养基中孵育后收集。β-actin用作上样对照。
(H) SH-SY5Y-Fra-1细胞中与Vec细胞相比AcH3K27水平降低的ARBSs最近基因的Reactome通路富集。
(I) SH-SY5Y-Fra-1细胞中与Vec细胞相比AcH3K27水平降低的ARBSs最近的代表性神经元相关基因的表达水平。通过qRT-PCR分析确定mRNA表达水平（N = 3，技术重复三次）。数据以均值表示。实验独立重复三次，结果一致，如补充生物学重复面板（图S7D）所示。
(J) SH-SY5Y-Fra-1和Vec细胞中NEFL位点周围代表性ChIP-seq轨道。
(K) SH-SY5Y-Fra-1细胞中Fra-1结合位点与Vec细胞中GATA3结合位点的重叠情况。使用显著的GATA3或Fra-1位点（P < 1E?4，FDR < 0.01）。
另见图S7。

随后我们将SH-SY5Y-Fra-1细胞中的ARBSs分为"高Fra-1"和"低Fra-1"两类（图7B）。有趣的是，AcH3K27 ChIP-seq分析显示，大多数具有"高Fra-1"结合信号的ARBSs与SH-SY5Y-Fra-1细胞中的AcH3K27激活区域重叠（图S7B；图7C）。仅有"低Fra-1"结合信号的ARBSs中有一半与AcH3K27区域重叠（图S7B；图7C）。在SH-SY5Y-Fra-1细胞中"高Fra-1"ARBSs周围，AcH3K27水平在SH-SY5Y-Fra-1和Vec细胞中均较高（图S7C）。因此，表观遗传激活促进了SH-SY5Y-Fra-1细胞中AR与Fra-1之间的协作。然而，在SH-SY5Y-Fra-1细胞中"高Fra-1"ARBSs周围且Vec细胞中表现出"高AcH3K27水平"的区域，我们注意到SH-SY5Y-Fra-1细胞中AcH3K27水平相比Vec细胞受到抑制（图7D和7E）。

总体而言，这些结果支持了这样的观点，即表观遗传变化可能由Fra-1和AR结合所诱导，并且依赖于Fra-1的结合水平（图7C）。我们进一步研究了这些表观遗传变化是否影响细胞身份。有趣的是，我们观察到在SH-SY5Y细胞中过表达Fra-1会显著改变细胞形态（图7F）。尽管分化的SH-SY5Y细胞呈现神经元样的细胞形态，但Fra-1的表达削弱了这些细胞形态变化，并抑制了NeuN表达的诱导（图7G）。这些观察结果提示，在神经元细胞模型中过表达Fra-1会导致细胞表型受到抑制。一致的是，在Fra-1高结合和Fra-1过表达导致AcH3K27水平受抑的ARBS附近的基因，与神经元活性通路显著相关（图7H）。我们观察到，与Vec细胞相比，SH-SY5Y-Fra-1细胞中结合AR和Fra-1的神经元特异性基因的mRNA表达水平降低（图7I和S7D）。这种Fra-1介导的神经元相关基因抑制作用以KLF7和NEFL为例，两者均为神经元轴发生所必需，这与免疫荧光研究的结果一致（图7F）。Fra-1过表达与AcH3K27的抑制相关，在NEFL基因座尤为明显（图7J）。ChIP-qPCR分析显示，Fra-1结合与AR招募相结合，与KLF7增强子区域中GATA3结合和AcH3K27修饰的减少相关（图S7E）。在机制上，SH-SY5Y-Fra-1细胞中显著Fra-1结合位点的一部分与SH-SY5Y-Vec细胞中的GATA3结合位点重叠（图7K）。我们发现，在结合峰周围的这些重叠区域中，GATA3和Fra-1结合基序均富集。这可能表明在特定的DNA位点存在潜在的竞争性占据，这可能涉及Fra-1对GATA3作用的抑制效果（图S7F）。在SH-SY5Y-Fra-1细胞中，被Fra-1过表达下调的AcH3K27区域中，AR和GATA3共同占据的区域显著富集（图S7G）。我们使用含有NEFL-ARBS的报告基因载体进行荧光素酶测定，发现添加Fra-1后荧光素酶活性降低。这种抑制作用通过突变GATA3结合基序得以缓解，提示GATA3结合依赖性机制可能参与其中（图S7H）。这些发现表明，Fra-1可能通过影响GATA3结合来抑制NEFL增强子活性。同样，ChIP-qPCR分析显示，与Vec细胞相比，SH-SY5Y-Fra-1细胞中两个GATA3/Fra-1重叠位点的GATA3结合水平降低（图S7I）。总体而言，这些结果表明Fra-1过表达可能通过影响表观遗传条件和抑制基因表达来抑制神经元细胞形态。因此，我们推测引入不同的AR结合转录因子可能会改变雄激素介导的转录调控的细胞特异性。

讨论

在本研究中，我们通过全基因组分析ARBS、组蛋白修饰和细胞特异性启动子元件，研究了神经元细胞类型特异性的雄激素信号通路对细胞身份调控的作用。此外，我们分析了在大脑老化和AD发展过程中AR调控机制如何受到影响。FOXA1是前列腺癌中AR信号通路的标志物，它使染色质准备就绪以接受核受体结合。相反，我们观察到协同转录因子GATA3可能在AR介导的神经元细胞类型特异性转录程序中发挥作用。AR与该特定转录因子的相互作用似乎对AR依赖性转录激活是必需的。因此，我们假设GATA3可以促进染色质中的表观遗传变化，从而招募AR以增强神经元功能。染色质可及性研究，如基于测序的转座酶可及染色质检测（ATAC-seq），可以直接检验GATA3是否在AR招募之前打开染色质，并揭示未来研究中GATA3在神经元细胞中的重要性。此外，GATA3被确定为MCF7人乳腺癌细胞中ERα的协同因子。GATA3可能是ERα形成的相分离复合物的组成部分。这些发现进一步证实了GATA3以背景依赖的方式介导类固醇激素信号传导。

在小鼠大脑发育中，主要的雄激素睾酮通过芳香化酶转化为雌激素发挥男性化作用。然而，睾酮也通过激活AR发挥其作用，AR突变的雄性小鼠不表现出性行为或攻击性。因此，睾酮对于雄性小鼠表现出性别特异性行为（如攻击性）至关重要。更重要的是，一项最近使用人类类器官模型的研究表明，雄激素而非雌激素特异性地增加了人兴奋性神经元前体的神经发生输出。我们目前的研究表明GATA3在AR功能中的重要性，暗示GATA3在AR通路中发挥协同作用，特别是在人神经元细胞中。一致的是，GATA3占据人神经母细胞瘤的启动子元件区域或来自大脑的亚群人神经元细胞中的开放染色质区域。此外，GATA3对于交感神经元谱系细胞的存活至成熟为成熟神经元是必需的，并参与小鼠中脑γ-氨基丁酸能神经元的发育，这对多巴胺能通路的发挥至关重要。此外，小鼠中的睾酮通过上调多巴胺能通路、调控多巴胺相关基因来刺激大脑功能，从而增加体力活动。因此，这些发现表明AR和GATA3协同诱导雄激素介导的神经元活性。

此外，我们对一组老年男性和年龄匹配的AD脑组织中ARBS进行了全面分析。有趣的是，我们观察到除了GATA3外，大脑相关转录因子如NRF1和SP1在人体大脑中与AR协同作用于神经元基因的启动子。我们还发现这些转录因子的表达水平因衰老或AD发展而出现异常。NRF1是脂肪组织中通过转录激活这些组分来调控线粒体生物发生和线粒体能量代谢的调节因子。NRF1在招募Polycomb抑制复合物1（PRC1）到染色质中起基本作用，从而在神经发育过程中调控基因表达。组蛋白H3赖氨酸4甲基转移酶MLL4与NRF1相互作用，激活生长激素释放激素（GHRH）相关神经元基因的转录。因此，NRF1对于协调特定的基因调控程序至关重要，该程序控制神经元分化。此外，Sp1也作为许多神经元相关基因的基本激活因子发挥作用。例如，Sp1控制p11的表达，这影响运动神经元的兴奋性和易感性。值得注意的是，我们发现Fra-1在老年人和AD患者脑组织中的表达增加，表明转录因子网络在人体大脑衰老过程中的动态变化。与我们的观察一致，AP-1转录因子（如Fra-1）在成纤维细胞系诱导衰老或脑损伤果蝇模型中的胶质细胞中被激活。此外，AP-1的激活诱导衰老相关分泌表型（SASP）相关基因，增强小鼠肾脏和肝脏中的炎症。总体而言，这些发现表明AP-1家族在衰老中具有重要作用。Fra-1在AD组织中表达增加与中度AD中AR结合峰周围Fra-1结合的富集一致，且伴随高活跃的组蛋白乙酰化。尽管Fra-1作为AR辅助因子在脑组织中的具体作用有待进一步研究，但这些发现表明这种相互作用可能有助于调节老化脑组织中的AR信号。

令人惊讶的是，尽管衰老过程中雄激素浓度降低，但非AD老年人脑中AR结合仍然保存。然而，Ct脑组织中许多ARBS丢失了，而在晚期AD脑组织中出现了AD特异性的AR结合。这一观察结果表明，AR信号在大脑中的减弱是由AD进展过程中AR结合被抑制或染色质重塑所致。RNA-seq数据显示，与对照相比，AD组织中AR结合基因富集的信号通路受到抑制，支持AR信号调控对促进神经细胞活性和预防AD发展有贡献的细胞过程。对这些AD特异性ARBS的基因组序列分析鉴定出其他转录因子的基序，包括STAT家族的基序。RNA-seq数据表明与炎症相关的转录因子如STAT3或STAT5，或旁分泌信号事件，是AD组织中AR结合谱分化差异的潜在驱动因素。值得注意的是，STAT家族与AR之间的相互作用也已在前列腺癌治疗耐药性的产生过程中被观察到。我们的发现强调了细胞背景和细胞信号改变作为晚期AD组织中AR顺式元件组分化破坏可能机制的重要性。此外，我们的研究为AD脑组织中出现下调的涉及AR结合基因的通路以及人脑组织中的功能和组织特异性AR靶点提供了初步见解。这些观察表明，这些通路和靶点可能与老年男性AD的进展相关。特别地，我们观察到线粒体ATP合成和蛋白酶体相关基因富集，提出了这些基因集可能作为疾病监测策略的潜在指标或AD治疗探索候选物的可能性。在本研究中，我们将距ARBS最近的基因定义为AR靶基因。然而，神经元染色质结构以极高的增强子密度、广泛的长程调控相互作用和高度细胞类型特异性的三维基因组组织为特征。此外，神经元包含大量极大的基因，其调控域跨越广阔的基因组区间。这些特征共同表明AR可能还以长距离和近距离方式调控靶基因。

此外，本研究中的一项重要观察是AR顺式元件组可根据表观遗传背景相互转换。我们观察到在神经元细胞模型中强制表达Fra-1影响了全面的组蛋白修饰和AR结合顺式元件组。通路分析揭示Fra-1过表达通过降低AcH3K27水平负向调控与神经功能和细胞身份相关的基因。我们推测Fra-1诱导的抑制活性可能有助于突触功能障碍，而突触功能障碍是AD最早期的病理特征之一。尽管AR顺式元件组重塑作为Fra-1介导的转录抑制的相关表现，但仍需进一步研究确定AR是否也在这种抑制作用中发挥作用。因此，Fra-1可能作为AR的协同转录因子，通过促进染色质中的表观遗传变化发挥作用。有趣的是，我们在荧光素酶测定中观察到GATA3结合和NEFL-ARBS处的增强子活性可能受Fra-1影响。然而，要验证这一假说，还需要进一步对Fra-1过表达后GATA3结合变化的全基因组分析。在乳腺癌细胞中，AP-1转录因子是维持GR结合的调控元件处染色质可及性所必需的。一种可能的机制是AP-1将SWI/SNF染色质重塑复合物（BAF）招募到许多增强子，通过核小体重塑建立可及染色质。总体而言，相关转录因子的异常表达可能调节组织特异性AR活性，并促成年龄相关疾病和痴呆症的发生发展。

我们提出了大脑组织中AR作用的新模型及相关假说。该模型需要通过额外研究进一步验证。首先，尽管本研究使用了两个对照样本来鉴定全面的ARBS，并进行了使用不同抗体的两次分析以确保特异性，但患者间的个体差异和大脑内区域异质性仍可能影响结果。AD3 ChIP-seq数据显示出高可重复性，Ct1/AD3区域的AR结合信号一致。信号在Ct1特有位点和独立数据集中仍然可检测，证实了AD3实验的有效性。尽管基因组唯一比对率较高，与其他样本相当（82.5%），但峰中reads的比例（Frip）相对较低（1.8%），低于对照和AD2样本（2-3%）（表S3）。AD3特异性ARBS在AR结合信号在其他样本中显著较低的区域内被鉴定。因此，需要更多验证分析来确定AD3特有位点是否代表真正的弱结合位点还是含有噪声。因此，需要其他大脑区域的额外样本和组织，通过进一步的AR ChIP-seq或ChIP-qPCR分析来验证这种变异性。其次，我们分析了颞叶灰质，组织组成的混杂因素是主要关切。老化脑组织细胞组成分析显示，与对照脑组织相比，AD大脑皮质中神经元细胞数量减少。在我们的RNA-seq数据中，NeuN表达无显著降低表明神经元细胞在我们的样本中相对保存。我们为这些测序分析收集了等量的灰质组织。

然而，通过每个样本量化的NeuN+比例进行标准化，对于确定AR结合是否在晚期AD组织中被抑制更为可取。晚期AD组织中ARBS的减少可能反映了神经元的丧失。AR结合或转录因子富集的变化可能反映了组织组成的改变，如神经元丢失、胶质细胞增生、炎症或区域异质性，而非神经元特异性AR重塑。对人脑组织的单细胞RNA测序分析对于确定相关细胞类型以及阐明所观察到的AR/Fra-1/STAT3和STAT5转录变化是否确实源于神经元将至关重要。第三，我们使用从男性获得的脑组织检查了AR结合事件。鉴于AR表达也在女性脑组织中检测到，通过进行女性样本的ChIP-seq分析来确定AR结合谱是否表现出性别特异性特征将非常重要。此外，阐明脑组织或神经元细胞中雌激素与雄激素信号之间的相互作用对于理解与性别相关的神经元功能机制将是必不可少的。

总体而言，我们概述了一个与神经元相关的转录网络，该网络似乎影响神经元和人脑组织中的AR信号传导。通过整合ChIP-seq和motif分析，我们鉴定出一组协作转录因子，如GATA3、NRF1、SP1和与年龄相关的AP-1成分Fra-1，它们可能共同维持并调节神经元AR染色质结合组。观察发现GATA3促进AR向富含神经元分化基因的超级增强子的招募，可能支持AR依赖的与神经元维护相关的转录程序。我们进一步观察到，该以AR为中心的转录因子网络在衰老和AD过程中显示出渐进性失调的迹象。我们展示了晚期AD以AR结合事件的抑制和分化以及STAT3和STAT5等炎症相关转录因子的激活为特征。在机制上，异常的Fra-1诱导可能干扰AR在关键调控元件处的结合，这可能导致活性组蛋白标记减少和神经元基因模块的抑制。这些发现表明，AD中AR信号的损伤可能不仅源于与年龄相关的雄激素下降，还可能源于支持AR功能的细胞类型特异性转录因子复合物的更广泛改变。我们的结果还表明，AR复合物的形成变化可能与分化或减少的AR结合事件相关联，而这些事件与表观遗传和转录改变有关。值得注意的是，我们揭示了协作转录因子表达的重大变化，这可能构成了与年龄相关疾病相关的细胞病理学基础。因此，这些观察结果指出，转录网络的完整性——而非单纯的激素水平——可能是AR在衰老大脑中功能的一个潜在决定因素，并为未来研究考虑转录因子和染色质相关途径提供了基础。有趣的是，最近的一项报告显示，在小鼠中通过外源性激活转录因子（包括OCT4）可以逆转表观遗传时钟并减轻体内衰老表型。通过与AR结合，OCT4增强了AR活性，从而加速了去势条件下前列腺癌的侵袭性。因此，调节AR相关转录因子可能代表一种有前景的治疗策略，用于维持组织特异性AR活性、减轻与衰老相关的衰退并减缓老年疾病的进展。

**研究的局限性**

本研究受到一些局限性的限制。在某些qPCR分析中使用了技术重复，尽管我们进行了至少两次相同实验以验证可重复性。生物学三重重复将是确认结果的必要步骤。未在实验重复中对脑组织进行ChIP-seq分析以显示个体间的可重复性。我们使用阈值p < 0.05、Log2FC > 1或< -1来鉴定DEGs（图S6D）。需要更多样本进行RNA-seq分析以通过Benjamini和Hochberg方法鉴定DEGs。我们使用人神经母细胞瘤来源的细胞系作为神经元细胞模型。尽管我们使用每个组内所有样本的合并input DNA进行了临床ChIP-seq分析，但每个样本的input更可取，因为合并背景可能扭曲异常文库中的peak call。图7中展示的细胞模型表明，Fra-1过表达驱动神经元基因中H3K27乙酰化（AcH3K27）的抑制。Fra-1在ARBS上的共结合在中等阶段样本（AD2）中观察到，但在晚期阶段样本（AD1/AD3）中减少。增加每个疾病阶段的样本量对于验证这些基于细胞的发现是否反映了Fra-1的临床病理生理作用将是必不可少的。Fra-1–GATA3置换机制在特定靶基因位点进行了评估。进一步对SH-SY5Y细胞中Fra-1过表达后GATA3结合变化的全基因组分析是必要的，以证明Fra-1过表达通过抑制GATA3结合来抑制增强子活性的机制。通过每个样本量化的NeuN+比例进行标准化对于确认AR结合在晚期AD组织中被抑制的观点更可取，因为晚期AD组织中ARBS的减少可能反映了神经元细胞的丧失。

**资源可用性**

**主要联系人**

请求进一步信息和资源应联系主要联系人并将由其主要联系人提供，Satoshi Inoue（[e-mail]）。

**材料可用性**

本研究未生成新的独特试剂。

**数据和代码可用性**

本研究新产生的测序数据可在NCBI Gene Expression Omnibus（GEO）上获取，编号为GSE328648、GSE260959、GSE259445、GSE260611、GSE295402（Microarray、ChIP-seq和RNA-seq）。原始实验数据已存入Mendeley，地址为https://doi.org/10.17632/pvt2x2nbyx.1。公开可用的RNA-seq数据可从GEO获取，登录号分别为GSE33000、GSE48350和GSE15222。本文未报告原创代码。任何重新分析本文报告数据所需的附加信息可通过主要联系人获取。

**致谢**

我们感谢参与本研究的所有实验室成员的有益讨论。我们感谢日本医科大学Kyoko Fujiwara博士为我们提供几种神经元细胞系。本工作得到了日本学术振兴会（25K02705、24K21297、21H04829（S.I.）、20K07350、23K06408（K.T.）和22H04923（CoBiA, Y.Sa.））、Takeda Science Foundation（K.T.和S.I.）、东京都老人和老人医学综合研究所痴呆症幸福生活综合研究计划（IRIDE）（K.T.、Y.Sa.、S.I.）、AMED（JP21wm0425019（Y.Sa.）、JP25gm2110001（S.I.））以及厚生劳动省罕见难治性疾病研究计划（JPMH23FC1008（Y.Sa.））的资助。

**作者贡献**

K. T. 设计了研究方案，进行了实验并分析了数据。S. T.、H.A.和Y. Su. 进行了序列分析；T.S. 进行了免疫组化；Y. Sa. 分析了人脑组织和病理；S.I. 监督了研究；K. T.和S. I. 撰写了论文。

**利益声明**

作者声明无竞争性经济利益。

**STAR★方法**

**关键资源表**

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| **抗体** | | |
| 抗NeuN | Abcam | ab104224; RRID: AB_10711040 |
| 兔多克隆抗AR | Abcam | ab108341; RRID: AB_2819013 |
| 兔多克隆抗GATA3 | Abcam | ab199428; RRID: AB_2154534 |
| 小鼠单克隆抗NRF1 | Abcam | ab55744; RRID: AB_2154534 |
| 兔多克隆抗AcH3K27 | Abcam | ab177178; RRID: AB_2828007 |
| 兔多克隆抗STAT5a/b | Abcam | ab194898; RRID: AB_2924353 |
| 小鼠单克隆抗β-actin | Sigma | A5441; RRID: AB_476744 |
| 小鼠单克隆抗Flag | Wako | 012-22384; RRID: AB_3094944 |
| 兔多克隆抗HA | Santa Cruz Biotechnology | Y-11; RRID: AB_631618 |
| 小鼠单克隆抗Fra-1 | Santa Cruz Biotechnology | D-3; RRID: AB_11012022 |
| 小鼠单克隆抗Stat3 | Cell Signaling Technology | #124H6; RRID: AB_331757 |
| 兔多克隆抗SP1 | Cell Signaling Technology | #9389; RRID: AB_11220235 |
| 兔多克隆抗AR | Cell Signaling Technology | #82055; RRID: AB_2936838 |
| 抗磷酸化Tau8 | Fujirebio | AT8:90206; RRID: AB_1152065 |
| 兔多克隆抗GATA2 | Proteintech | 11103; RRID: AB_10914503 |
| 抗小鼠IgG, 辣根过氧化物酶 | GE healthcare | NA931; RRID: AB_772210 |
| 抗兔IgG, 辣根过氧化物酶 | GE healthcare | NA934; RRID: AB_772206 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure驴抗兔IgG | ThermoFisher | R37118; RRID: AB_2556546 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure驴抗小鼠IgG | ThermoFisher | R37115; RRID: AB_2556543 |
| **细菌和病毒菌株** | | |
| One ShotTM Stbl3TM化学感受态大肠杆菌 | Thermo Fisher Scientific | C737303 |
| **生物样本** | | |
| 石蜡包埋脑组织样本 | 东京都老人和老人医学综合研究所 | https://www.tmghig.jp/research/en/eresearch/researchteam/vice01/team-05/a23/ |
| 冷冻脑组织样本 | 东京都老人和老人医学综合研究所 | https://www.tmghig.jp/research/en/eresearch/researchteam/vice01/team-05/a23/ |
| **化学品、多肽和重组蛋白** | | |
| 二氢睾酮（DHT） | Wako | 045-26071 |
| 视黄酸 | Nacalai | 36331-31 |
| Protein G-sepharose | GE healthcare | 17-0618-01 |
| **关键商业检测** | | |
| ISOGEN II | Nippon Gene | 311-07361 |
| GeneChip Human Clariom S Array | Thermo Fisher | 902926 |
| NEBNext Ultra RNA文库试剂盒 | NEB | E3330 |
| Histofine kit | Nichirei | 414481 |
| FBlocking One | Nacalai | 03953-95 |
| PrimeScript RT试剂试剂盒 | TAKARA | RR037A |
| KAPA SYBR Green | Sigma | KK4605A |
| LP assay kit | TAKARA | MK301 |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778150 |
| X-tremeGene HP DNA转染试剂 | Roche | 6366236001 |
| Dual Luciferase Assay Kit | Promega | E1910 |
| **存储数据** | | |
| RNA-seq | 本文 | GEO: GSE328648 |
| Microarray | 本文 | GEO: GSE260959 |
| AR, AcH3K27的ChIP-seq | 本文 | GEO: GSE259445 |
| GATA3, Fra-1, AcH3K27, AR的ChIP-seq | 本文 | GEO: GSE260611 |
| AR, AcH3K27, Fra-1, GATA3, NRF1, SP1的ChIP-seq | 本文 | GEO: GSE295402 |
| 来自死后脑样本人类RNA表达数据 | NCBI | GEO: GSE33000 |
| 来自死后脑样本人类RNA表达数据 | NCBI | GEO: GSE15222 |
| 来自死后脑样本人类RNA表达数据 | NCBI | GEO: GSE48350 |
| 人脑图谱 | Miller JA等人 | http://aging.brain-map.org/ |
| 免疫印迹、qPCR、荧光素酶测定和免疫荧光分析的原始实验数据 | Mendeley | https://doi.org/10.17632/pvt2x2nbyx.1 |
| **实验模型：细胞系** | | |
| U2OS | ATCC | CRL-3455 |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 |
| Kelly | 日本医科大学 | CVCL_2092293 |
| 293T | 埼玉医科大学 | CRL_3216 |
| **寡核苷酸** | | |
| siRNA GATA3 #1 | Thermo Fisher | s533214 |
| siRNA GATA3 #2 | Thermo Fisher | s5599 |
| **重组DNA** | | |
| Flag-AR-pcDNA3.0 | Takayama等人 | N/A |
| Flag-Fra-1-pcDNA3.0 | 本文 | N/A |
| HA-GATA3-pcDNA3.0 | 本文 | N/A |
| Flag-GATA3-mCherry-pcDNA3.0 | 本文 | N/A |
| Venus-AR-Flag-pcDNA3.0 | Takayama等人 | N/A |
| Venus-Flag-pcDNA3.0 | Takayama等人 | N/A |
| Flag-mCherry-pcDNA3.0 | Takayama等人 | N/A |
| pGL3 KCNH2 ARBS载体 | 本文 | N/A |
| pGL3 HAND2 ARBS载体 | 本文 | N/A |
| pGL3 HAND2 ARBS突变载体 | 本文 | N/A |
| pGL3 NFIX ARBS载体 | 本文 | N/A |
| pGL3 KLF7 ARBS载体 | 本文 | N/A |
| pGL3 KLF7 ARBS突变载体 | 本文 | N/A |
| **软件和算法** | | |
| Prism 6 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| DAVID | David Bioinformatics | https://david.ncifcrf.gov |
| HOMER | 加州大学圣地亚哥分校 | http://homer.ucsd.edu/homer/ |
| 基于模型的ChIP-seq分析（MACS） | Zhang等人 | https://github.com/macs3-project/MACS |
| ROSE | Young Lab | https://younglab.wi.mit.edu/super_enhancer_code.html |
| R, v4.0.2 | R核心团队 | https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ |
| ImageJ | ImageScience库 | https://imagej.net/ij/ |
| NeuroJ | ImageScience库 | https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/ |
| Bowtie2 | 约翰霍普金斯大学 | https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml |
| Trimmomatic_0.38 | Usadel lab | https://github.com/usadellab/Trimmomatic/releases/tag/v0.38 |
| HISAT2_2.1.0 | Kim等人 | https://github.com/DaehwanKimLab/hisat2 |
| DESeq2_1.24.0 | Love等人 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html |
| featureCounts_1.6.3 | Yang等人 | https://scienceparkstudygroup.github.io/ibed-bioinformatics-page/source/core_tools/featurecounts.html |
| NGSPLOT (v.2.47.1) | Shen等人 | http://genocat.tools/tools/ngs.plot/ |
| bedtools (v2.31.1) | Quinlan等人 | https://github.com/arq5x/bedtools2 |

**实验模型和受试者详情**

**细胞培养**

人U2OS和SH-SY5Y细胞系购自美国模式培养物收藏中心（ATCC）。人Kelly细胞来自日本医科大学，293T细胞由埼玉医科大学提供。U2OS和293T细胞在含有10%胎牛血清（FBS）、50 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。Kelly细胞在含有10% FBS、50 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素的RPMI培养基中维持。SH-SY5Y细胞在含有5 mM L-谷氨酰胺、10% FBS、50 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素的Advanced DMEM/F-12（ThermoFisher）培养基中生长。对于SH-SY5Y细胞的神经元分化，将细胞在含有酚红免费DMEM/F-12培养基中培养，补充3% FBS、5 mM L-谷氨酰胺、10 μM视黄酸（RA）、50 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素，实验操作前5–7天有或无0.1 nM DHT。我们使用NeuroJ量化细胞分化检测中神经突的长度。所有细胞系均在37°C、5% CO2的湿润培养箱中培养。使用基于PCR的支原体检测试剂盒（Jena Bioscience, Jena, Germany）定期进行支原体污染检查。所有细胞系均通过短串联重复（STR）测试进行鉴定。低传代细胞库存已制备用于实验，培养物每月用新鲜安瓿补充以维持细胞活力。

**临床样本**

来自日本老年患者的死后脑组织样本，诊断为阿尔茨海默病（AD）（79–86岁）和无AD的对照个体（72–88岁），取自东京都老人和老人医学综合研究所脑库（https://www.tmghig.jp/research/en/eresearch/researchteam/vice01/team-05/a23/）。对照组显示无或轻微阿尔茨海默型病理（CDR 0–0.5; Braak NFT 0.5–2; CERAD 0–1），而AD组表现出与确诊阿尔茨海默病一致的高级神经病理变化（CDR 2–3; Braak NFT 2–6; CERAD 3; Thal 3–5）。研究方案经东京都老人和老人医学综合研究所伦理委员会（批准号：R21-059）和东北大学（批准号：2021-1-843）审查并批准。所有方法均遵守相关伦理指南和法规，使用的脑组织样本已匿名化。已从供者或其法定代理人处获得组织捐赠和研究使用的书面知情同意书。患者附加信息汇总于表S1。

**方法细节**

**定量RT-PCR分析**

按照制造商方案使用ISOGEN II（Nippon Gene）从组织或细胞中提取总RNA。使用PrimeScript（TAKARA Bio, Kyoto, Japan）将等量总RNA进行逆转录，按制造商说明操作。使用StepOne PCR System（Thermo Fisher）和KAPA SYBR Green（Sigma）进行定量RT-PCR。实验组的fold change以装载对照（GAPDH）为归一化标准，使用ΔΔCt法计算。对于ChIP-qPCR分析，使用阴性对照位点（肌红蛋白（MB））进行ChIP信号归一化。引物序列见表S2。

**ChIP实验**

细胞和冷冻人组织在室温下用1%甲醛交联10分钟，随后用125 mM甘氨酸淬灭5分钟。组织在冰上用膨胀缓冲液（25 mM HEPES pH7.8, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.1% NP40, 1 mM DTT）孵育30分钟。细胞解离和核提取通过Dounce匀浆器（Active Motif）匀浆完成。核离心后，所得沉淀重悬于ChIP裂解缓冲液（50 mM Tris HCl pH 8.1, 10 mM EDTA, 1% SDS）中。交联细胞和组织的染色质使用超声仪（Bio-Rad）进行剪切，循环12次，每次30秒开启和30秒关闭。离心后收集含有染色质的上清液。样品用ChIP稀释缓冲液（0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl（pH 8.0）, 167 mM NaCl）稀释。预清除后的样品与相应抗体过夜孵育，用Protein G-Sepharose珠子（GE Healthcare, Chicago, IL）沉淀。

DNA-蛋白质-抗体复合物用放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（低盐 150 mM，高盐 500 mM NaCl，50 mM Tris-HCl（pH 8.0），1 mM EDTA，0.1% SDS，1% Triton X-100，0.1% 去氧胆酸钠）、锂盐缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 8.0），1 mM EDTA，1% NP-40，0.1% 去氧胆酸钠，500 mM LiCl2）以及Tris-EDTA（TE）缓冲液（10 mM Tris-HCl（pH 8.0），1 mM EDTA）进行洗涤。磁珠重新悬浮于洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl（pH 8.0），5 mM EDTA，300 mM NaCl，0.5% SDS）中，并在65°C下过夜孵育以解交联。免疫沉淀的DNA通过酚-氯仿提取和乙醇沉淀进行纯化。

ChIP-seq及数据处理

在SH-SY5Y细胞中对AR、组蛋白H3K27乙酰化（AcH3K27）、Fra-1和GATA3进行ChIP-seq；在人脑组织中对AR（靶向N端或C端的抗体）、GATA3、NRF1、Fra-1、SP1和AcH3K27进行ChIP-seq，使用NovaSeq 6000系统（Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚州）进行高通量测序。文库按照Illumina的规程制备。进行了未过滤的单端150 bp测序。为确保数据准确性，我们验证了质量控制分数（Q-score）高于30。使用Trimmomatic_0.38去除接头序列，然后将所得reads用Bowtie比对到人参考基因组（hg19）。使用samtools将Sam转换为Bam后，使用基于模型的ChIP-seq分析（MACS）v1.4.2计算转录因子结合富集相对于输入对照的峰值（Input对照通过汇集每组所有样本的输入DNA制备），显著性阈值为p < 1.0E?4，错误发现率（FDR）< 0.01。测序标签数量、比对率或获得的结合位点汇总于表S3中。使用整合基因组浏览器进行数据可视化。使用HOMER进行基序发现分析（ChIP-seq获得的峰值周围±50 bp）和结合位点重叠分析。使用来自Young实验室网站（http://younglab.wi.mit.edu/super_enhancer_code.html）下载的超级增强子排名（ROSE）鉴定超级增强子。我们使用默认设置（拼接距离：12.5 kb，TSS排除区域大小：0）鉴定SE区域。使用NGSPLOT（v.2.47.1）分析ChIP-seq标签在峰值周围的富集分布。使用HOMER和NGSPLOT获得每个AR结合峰值中心左右两侧的ChIP-seq信号热图谱。通过100次迭代的置换分析评估峰值重叠的显著性。使用bedtools shuffle将AR峰值的基因组坐标在人基因组（hg19）上随机重新分配。使用bedtools intersect将随机区域与其他峰值取交集，确定偶然预期重叠峰值数量。富集倍数计算为观察重叠计数与平均预期背景计数的比值。对于HOMER分析，我们使用了以下代码：基序分析：findMotifsGenome.pl peak_file.txt hg19 output_directory/-size 50 -mask；鉴定ChIP-seq峰值最近基因：annotatePeaks.pl peak_file.txt hg19；重叠：mergePeaks（默认设置：-d given）。为利用微阵列或RNA-seq数据整合AR结合基因调控，我们首先生成了一组与鉴定出的ChIP-seq峰值相邻的基因列表，然后通过使用join命令将这些基因名与微阵列或RNA-seq数据匹配，确定数据集之间的重叠基因集，并使用提取的文件进行进一步分析。

微阵列分析

为调查AR调控的转录程序，进行了微阵列分析。使用RNA生物分析仪（Agilent，Waldbronn，德国）验证RNA样本的高质量（RNA完整性分数 >9.0）。使用GeneChip Human Clariom S Array或D Array（Affymetrix，Santa Clara，CA）进行基因表达微阵列分析，按照制造商的规程操作。使用Affymetrix Microarray Suite软件进行数据分析。对所有探针集进行归一化以方便芯片间比较。使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，通过数据库注释、可视化和整合发现（DAVID 6.7，http://david.nciffrf.gov/）进行。此外，使用R包clusterProfiler进行基因本体（GO）术语和Reactome通路分析的进一步分析。使用clusterProfiler时，我们使用了以下代码：enrichGO(gene, OrgDb = "org.Hs.e.g.db", keyType = "SYMBOL", ont = "BP")，library(ReactomePA), enrichPathway(pvalueCutoff = 0.05)。使用Benjamini-Hochberg方法计算校正后的P值。

RNA-seq分析

每个样本约50–100 mg脑组织（颞叶灰质）用于RNA提取。按照制造商的规程使用ISOGEN II（Nippon Gene）从组织或细胞中提取总RNA。使用Agilent Bioanalyzer检查RNA质量。选择具有适当RNA完整性分数（>6）的样本进行RNA-seq研究。使用Illumina NovaSeq X Plus（Illumina）对人脑组织进行链特异性RNA-seq分析。按照制造商的规程使用NEBNext Ultra RNA Library Kit for Illumina（NEB）进行文库构建。测序仪产生的信号强度转换为fastq文件，并验证每碱基序列质量较高（>30）。原始RNA-seq reads首先使用Trimmomatic_0.38进行修剪。修剪后的reads使用HISAT2_2.1.0比对到hg19人参考基因组。Sam文件通过samtools转换为Bam文件。使用featureCounts_1.6.3生成原始计数以估算唯一比对的reads丰度。使用相对日志归一化（RLE）对原始read计数进行归一化，并使用DESeq2_1.24.0进行差异表达分析。根据原始P值 <0.05、Log2FC（倍数变化）> 1的阈值鉴定AD脑组织（N = 3）与对照组（N = 3）之间的差异表达基因（DEGs）。通过应用Benjamini-Hochberg校正后p < 0.05、Log2FC（倍数变化）> 1的阈值鉴定AD脑组织（N = 3）与对照组（N = 4）之间的DEGs。使用DAVID 6.7进行KEGG通路富集分析。我们选择通过Benjamini-Hochberg校正达到显著的条目（p < 0.05）。

公开可用的转录数据

从GSE15222下载处理过的人颞叶皮层脑样本（对照组、AD样本）的微阵列数据，以分析对照组与AD之间的基因表达差异。使用Mann-Whitney U检验获得P值。使用GEO2R从GEO数据库鉴定与AD组织相比在非AD中下调的基因。设置Benjamini & Hochberg方法P值 <0.01以及Log2FC < ?0.5和?0.2作为阈值。从GSE48350下载处理过的人脑样本微阵列数据用于分析衰老引起的表达变化。使用Pearson相关分析获得P值。从Allen脑图谱（可从：http://aging.brain-map.org/ 获取）下载不同区域正常脑组织的微阵列数据。使用Spearman秩相关评估显著性。

免疫组织化学

福尔马林固定组织包埋在石蜡中并切片。组织切片脱蜡，在梯度乙醇系列中复水，并用蒸馏水冲洗。抗原修复通过将载玻片在90°C水浴中用柠檬酸缓冲液（2 mM柠檬酸和9 mM柠檬酸三钠二水合物，pH 6.0）孵育30分钟进行。用3%过氧化氢（H2O2）阻断内源性过氧化物酶活性。然后将切片与一抗抗磷酸化Tau8（AT8:90206；Fujirebio，东京，日本）在4°C下孵育过夜。按照制造商的规程使用Histofine试剂盒（Nichirei）进行染色。使用3,3′-二氨基联苯胺（DAB）溶液（1 mM 3,3′-二氨基联苯胺，50 mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.6，0.006% H2O2）使抗原-抗体复合物显色。

免疫荧光

将细胞培养在24孔板中的12 mm圆形盖玻片（Fisher Scientific）上，用4%多聚甲醛在室温下固定10分钟。使用磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的0.5% Triton X-100进行透化2分钟。用PBS冲洗后，用Blocking One（Nacalai，东京，日本）封闭30分钟。然后将细胞与抗AR抗体在PBS中4°C孵育过夜。用PBS洗涤三次后，将细胞与PBS中用Alexa Fluor 546偶联的抗小鼠IgG在PBS中孵育1小时。用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行核复染。再用PBS冲洗三次后，将盖玻片封片在甘油中，并使用共聚焦激光扫描显微镜（FV10i；Olympus，东京，日本）进行观察。为了对蛋白质表达进行活细胞成像，将U2OS细胞接种在玻璃底部微量培养皿（Matsunami Glass）中。转染Venus-AR和mCherry-GATA3的细胞在无激素培养基中培养48小时。成像分析前，用对照溶剂或10 nM双氢睾酮（DHT）处理细胞6小时。

siRNA转染

使用Lipofectamine RNAi MAX（ThermoFisher）按照制造商的说明进行siRNA转染。对照siRNA和GATA3靶向siRNA从Thermo Fisher Scientific购买（siRNA编号：s533214（#1）和s5599（#2））。

Western blot和免疫沉淀

使用NP40缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 7.6），150 mM NaCl，1% NP40）补充1%蛋白酶抑制剂混合物（Nacalai，东京，日本）收集细胞。组织在相同缓冲液中匀浆。使用BCA检测试剂盒（Pierce，东京，日本）测定蛋白质浓度。制备的裂解液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后电泳和电转移至硝酸纤维素膜上。膜用Blocking One（Nacalai，东京，日本）封闭1小时，并与特异性一抗在4°C下孵育过夜。用含Tween 20的Tris缓冲盐水（TBS-T）洗涤后，膜与二抗孵育1小时。使用Western blot试剂（Pierce）使抗原-抗体复合物显色。对于免疫沉淀，提取物与指定抗体在4°C下孵育过夜，然后用蛋白G琼脂糖珠（GE Healthcare）混合2小时。珠用裂解缓冲液洗涤三次，重新悬浮在1×上样缓冲液（Nacalai，东京，日本）中并煮沸。使用ImageJ（https://imagej.net/）通过测量条带强度分析蛋白质表达水平。

荧光素酶报告基因检测

将SH-SY5Y细胞以3 × 10?个细胞/孔的密度接种在24孔板中。次日，将培养基替换为不含酚红的DMEM/F-12并补充10%炭条脱脂胎牛血清。将含有通过ChIP-seq鉴定的细胞特异性ARBS序列的载体进行转染。转染混合物包括荧光素酶报告质粒和Tk-pRL载体（Promega，Madison，WI）作为内参。使用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent（Roche）进行转染。孵育24小时后，用10 nM DHT或对照溶剂（0.1%乙醇）再处理24小时。使用双荧光素酶检测试剂盒（Promega）配合自动发光计测定荧光素酶活性。火fly荧光素酶活性归一化至海肾荧光素酶活性。突变序列汇总于表S4中。

构建

GATA3和AR的编码序列被扩增并克隆到表达载体pcDNA3.0中（带Flag标签或HA标签）。Venus-Flag标签的pcDNA3通过从USE10C/pCS2（RIKEN BRC DNA BANK）扩增Venus序列并亚克隆到带有C端FLAG标签的pcDNA3.0中合成。Flag-mCherry-pcDNA3通过从pET-mCherry（RIKEN BRC DNA BANK）扩增mCherry序列并亚克隆到带有N端FLAG标签的pcDNA3.0中合成。然后将Venus-Flag标签的AR通过从cDNA中克隆编码序列到EcoRV/XhoI限制性位点合成。Flag-mCherry标签的GATA3通过将GATA3编码序列亚克隆到EcoRI/EcoRV限制性位点合成。为构建ARBS的荧光素酶载体，每个增强子区域通过PCR扩增并克隆到pGL3-SV40启动子载体（Promega）中使用MluI/XhoI位点。质粒DNA转化到感受态细胞中扩增，并使用Maxiprep质粒提取试剂盒（Qiagen）纯化。

定量和统计分析

所有数据以均值±标准差（s.d.）表示。除高通量测序实验外，生化和细胞实验至少重复两次，并获得了相似的结果。使用Pearson或Spearman相关分析评估变量间的相关性，给出相关系数（r）和P值。使用卡方检验比较组间分类变量。使用双侧Student's t检验比较两组的统计显著性。对于非正态分布数据，使用Mann-Whitney U检验。当比较两组以上时，进行单因素方差分析（ANOVA）并进行Tukey事后检验。对于涉及两个独立变量的比较，进行双因素ANOVA并进行Dunnett事后检验。在RNA-seq差异表达分析中使用DESeq2获得P值。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。细胞系的定量PCR（qPCR）分析使用技术重复，而其他所有分析使用生物重复。使用的统计检验方法、重复次数和P值在图注中描述或显示在面板中，相关因素汇总于表S5中。

统计分析使用MS Excel（Microsoft，美国华盛顿州雷德蒙市）和GraphPad Prism 6.0版（GraphPad Software，美国加利福尼亚州拉霍亚市）完成。补充信息（6）下载全部PDF（1.30 MB）文档S1. 图S1–S7 电子表格（11.66 KB）表S1. 患者临床和病理信息汇总 电子表格（10.02 KB）表S2. qPCR引物序列 电子表格（11.75 KB）表S3. ChIP-seq操作流程汇总 电子表格（9.43 KB）表S4. 荧光素酶载体构建引物 电子表格（12.85 KB）表S5. 相关统计结果