呼吸系统疾病基因编辑：从人源临床前模型到未来治疗

《Biomedicines》：Gene-Editing in Respiratory Disease: From Pre-Clinical Human Models to Future Therapeutics

慢性肺疾病源于环境暴露与宿主遗传因素之间复杂的相互作用。然而，这些相互作用尚未被完全理解，尽管经过数十年研究，许多患者仍缺乏有效的治愈性疗法。近期治疗性基因编辑的突破已使部分遗传性血液疾病成为现实，并成为单基因肺疾病有前景的方法。针对α₁-抗胰蛋白酶缺乏症（AATD）的早期临床研究正在进行，主要通过对肝细胞进行肝脏定向编辑以恢复循环功能性α₁-抗胰蛋白酶（AAT），以及利用基因编辑免疫细胞方法治疗COVID-19。然而，对肺上皮细胞进行直接in vivo基因编辑在很大程度上仍处于临床前阶段。扩展该治疗管线需要克服肺独特的生物学屏障，并开发能够忠实重现人类疾病机制的人特异性模型。基因编辑技术的进展，包括CRISPR-Cas9系统、碱基编辑器和先导编辑器（base and prime editors）以及新兴的紧凑型核酸酶（compact nucleases），提高了精确基因组校正的可行性。然而，安全且高效地直接递送至肺仍是一个主要未满足的挑战，原因包括黏液（mucus）、表面活性物质（surfactant）、上皮紧密连接（epithelial tight junctions）和先天免疫监视（innate immune surveillance）。递送系统如工程化腺相关病毒（AAV）、慢病毒载体（lentiviral vectors）、选择性器官靶向脂质纳米颗粒（SORT LNPs）以及可气雾化制剂如雾化或干粉纳米颗粒（nebulised or dry powder nanoparticles）正开始应对这些障碍。与此同时，人类临床前模型已从传统细胞系发展到更复杂的平台，如诱导多能干细胞（iPSC）来源的气道和肺泡细胞、类器官（organoids）、精密肺切片（PCLS）、气液界面（ALI）培养、器官芯片（organ-on-a-chip）装置和患者来源原代细胞。这些模型使机制探究、变异特异性功能评估以及更具生理相关性的基因编辑策略临床前评价成为可能。在本综述中，研究人员详细介绍了当前和新兴的基因编辑工具、递送策略和人相关疾病模型。研究人员强调了关键转化障碍，并讨论了先进人类模型与改进递送技术相结合如何能够加速安全有效基因编辑治疗药物用于慢性呼吸系统疾病的开发。

1. 引言
慢性呼吸系统疾病（CRDs）是全球重大健康负担，包括慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺纤维化（PF）、囊性纤维化（CF）和α₁-抗胰蛋白酶缺乏症（AATD）等。其发生涉及环境暴露与遗传因素复杂交互，现有治疗疗效不一，肺损伤常不可逆，肺移植需求难以满足。基因编辑进展显著，Casgevy?获批用于镰状细胞病和β-地中海贫血，靶向KLKB1的脂质纳米颗粒（LNP）递送Cas9系统在体内编辑中展示持续基因失活和遗传性血管性水肿发作减少。AATD和COVID-19早期临床研究已开展，但肺上皮细胞直接in vivo编辑仍多处于临床前。肺分支结构、黏液、表面活性物质、紧密连接和先天免疫防御限制递送。传统动物模型和永生化细胞系不足以完全重现人类肺生物学，iPSC来源肺细胞、类器官、精密肺切片（PCLS）、气液界面（ALI）、器官芯片（OOC）和患者来源原代细胞等平台提供了更高生理相关性。本综述围绕基因编辑工具、递送策略、人源疾病模型及转化障碍展开。

2. 基因编辑工具
早期工具转录激活因子样效应核酸酶（TALEN）由Fok-1融合蛋白构成并以异二聚体发挥作用，主要限制为尺寸大和蛋白工程复杂，但可靶向重复序列如异染色质，并已用于肺模型构建。CRISPR系统通过向导RNA（gRNA）引导CRISPR相关蛋白（Cas）至原间隔序列邻近基序（PAM）附近，Cas9产生平末端双链断裂（DSB），Cas12a产生交错末端；Cas12a-Ultra可提高难转染细胞编辑效率。Cas蛋白免疫原性仍是临床障碍。紧凑型核酸酶Cas12f因体积小可包装入单AAV，Al3Cas12f RKK变体编辑效率由不足10%提高至约80%。碱基编辑包括腺嘌呤碱基编辑（ABE）和胞嘧啶碱基编辑（CBE），使用Cas切口酶或失活Cas（dCas），可降低DSB、染色体重排和p53激活风险；ABE已在患者来源iPSC中纠正AATD的Glu342Lys变体。先导编辑（PE）结合Cas切口酶、逆转录酶和先导编辑向导RNA（pegRNA），无需修复模板，但效率可能较低，且仍可能产生DSB、大缺失、易位和细胞应激。肽核酸（PNA）具有高结合稳定性和低脱靶，三链形成PNA可激活DNA修复，但仍处早期。CRISPR激活（CRISPRa）和CRISPR干扰（CRISPRi）利用dCas9实现可逆激活或抑制，已用于肺病相关非编码区、GWAS位点和CEBPA在IPF成纤维细胞中的研究。长期编辑气道和肺驻留祖细胞时，需关注克隆能力、细胞应激和基因组不稳定等风险。

3. 肺递送屏障
肺的复杂解剖、动态生理和多层防御共同限制基因编辑工具递送。颗粒大小影响沉积：大于5 μm颗粒多因撞击滞留于支气管，1–5 μm颗粒在细支气管和肺泡沉降，小于0.5 μm颗粒多被呼出。黏液层主要由MUC5AC和MUC5B黏蛋白及纤毛周围液体（PCL）构成，黏液纤毛清除限制纳米颗粒和病毒载体扩散；CF中CFTR突变导致离子吸收与氯离子分泌失衡，黏液清除改变；COPD也以黏液过表达和气流受限为特征。紧密连接维持上皮屏障和顶端–基底极性，限制位于基底外侧的AAV等载体受体；敲除Crumbs 3可改变糖基定位并增强AAV附着和转导。表面活性物质可导致纳米颗粒聚集或肿胀，SP-A和SP-D可结合吸入颗粒并增强免疫细胞摄取。肺泡巨噬细胞、树突状细胞和间质巨噬细胞通过吞噬和抗病毒反应清除载体，疾病肺中炎症、纤维化或感染进一步放大该屏障。气道和肺泡液中DNase和RNase降解核酸，IPF中细胞外基质（ECM）沉积阻碍载体扩散。细胞代谢状态也影响LNP摄取和mRNA表达，补充甲硫氨酸、精氨酸和丝氨酸（AAS）可在多种细胞、递送途径和制剂中使mRNA表达增加5–20倍。克服这些屏障需合理载体工程、表面修饰、气雾剂兼容配方和人源模型评估。

4. 向肺递送基因治疗的平台
肺基因编辑递送平台分为病毒和非病毒载体。腺相关病毒（AAV）是临床进展最先进的病毒载体，为非包膜病毒，携带约4.7 kb单链DNA（ssDNA）基因组，容量小，双AAV系统可增加容量；AAV可触发先天和适应性免疫，删除CpG基序或衣壳工程可减轻反应，健康人群中存在中和抗体；肺相关血清型包括AAV1、AAV4、AAV5、AAV6和AAV9。双AAV常用于递送spCas9及gRNA和同源定向修复模板，双重组AAV也可递送碱基编辑器。辅助依赖腺病毒（HD-AdV）无病毒编码序列，容量约36 kb，免疫原性较低，但不能复制，需辅助病毒，存在污染风险。慢病毒（LV）为包膜逆转录病毒，约10.7 kb单链RNA（ssRNA）基因组，可稳定整合并转导非复制和终末分化细胞如AT₁细胞，但不适合递送TALEN，整合酶缺陷慢病毒（IDLV）可减少整合。非病毒系统中，阳离子LNP可递送TALEN和CRISPR，容量较大；核糖核蛋白（RNP）可递送Cas9和ssDNA模板，毒性和免疫原性较低，但封装困难。选择性器官靶向LNP（SORT LNP）已用于静脉递送CRISPR至肺基底细胞，在CFTR基因中实现DSB和同源定向修复（HDR），转染约60%肺基底细胞。细胞穿透肽（CPP）和雾化纳米颗粒等也具潜力。总体而言，尚无单一系统能同时实现高效、安全和肺特异性靶向。

5. 人临床前模型中的基因编辑
ALI培养将原代气道上皮细胞接种于胶原基质Transwell插入物，顶端暴露空气、基底侧接触培养基，可诱导假复层、紧密连接、纤毛、黏液分泌和黏液纤毛转运，适用于载体趋向性、屏障穿透和顶端递送研究。ALI研究揭示腺病毒载体转导需上皮损伤或钠癸酸（C10）处理，并可结合气雾暴露系统测试纳米颗粒和干粉等。其局限包括原代细胞获取有限、患者间差异、有限增殖能力，以及缺乏免疫、基质和血管成分。iPSC来源肺模型可定向分化为AT₁、AT₂、气道基底细胞和巨噬细胞，并用于生成同基因疾病模型。CF中纠正CFTR突变后可比较突变与修复基因型，并通过球体肿胀和ALI电生理评估功能救援；AATD中碱基编辑可纠正SERPINA1 Z突变；还用于表面活性蛋白突变相关间质性肺病和Hermansky–Pudlak综合征。局限为发育不成熟、分化效率变异，可能影响编辑结果。三维肺类器官包含多细胞结构，已用于NKX2-1激活、ACTB位点转基因整合和TP53敲除，但缺乏血管化、呼吸机械力和完整免疫。肺芯片模拟动态呼吸、机械拉伸、共培养和微流体，已用于CFTR研究，但通量低、标准化不足。精密肺切片（PCLS）保持天然结构，适合短期评估，但无循环、活力有限、供体差异大；离体肺灌注（EVLP）可全肺水平评估，Mesaki等实现人肺离体基因组编辑并在PCLS中评估14天，但器官来源、成本、实验窗口和缺乏全身免疫整合限制应用。这些平台需互补整合。

6. 将体外研究转化为未来治疗
呼吸系统基因编辑治疗转化需整合疾病机制、靶细胞、递送策略和遗传校正持久性。长期疗效通常要求靶向组织驻留干细胞和祖细胞。气道上皮基底干细胞是上皮更新关键单位，是CF等持久纠正的主要靶标；远端肺中AT₂细胞是肺泡祖细胞，是PF等疾病的重要靶标。AATD中，肝细胞而非气道上皮细胞是主要治疗靶标，因肝细胞负责系统蛋白产生，肝靶向mRNA编码ABE的LNP策略正在探索。CF等气道疾病需递送至基底干细胞，但黏液、紧密连接和载体穿透限制体内编辑效率，并影响病毒、非病毒或离体策略选择。成功策略需对齐疾病机制、靶细胞类型、编辑模态和递送途径；临床前模型不仅评估技术性能，也用于定义可实现持久校正的合适细胞靶标。

7. 新兴基因编辑治疗
新兴基因编辑治疗已显示临床可行性。离体纠正患者来源祖细胞后自体移植是策略之一，Kuhn等用TALEN纠正人iPSC来源巨噬细胞，恢复其功能；在遗传性肺泡蛋白沉积症（herPAP）中，肺泡巨噬细胞祖细胞移植至小鼠肺可在6周至9个月植入，并在人源化小鼠中改善疾病表型。体内编辑方面，氨基甲酰磷酸合成酶1缺乏症（CPS1D）新生儿接受LNP递送碱基编辑治疗，两次给药后蛋白摄入改善、氮清除剂需求减少，7周随访体重增加且神经状态稳定，仍需长期安全性和有效性评估。AATD中，BEAM-302（NCT06389877）为Phase 1/2研究，评估LNP递送mRNA编码ABE靶向肝脏治疗PiZZ AATD相关肺和/或肝病；CTX460基于SyNTase?编辑平台，在临床前AATD模型中单剂LNP递送实现超过90% mRNA纠正和总AAT增加超过5倍。CRISPR筛选、CHOPCHOP、CRISPRscan和GenKI等工具支持靶点发现。iPSC来源肺细胞移植小鼠可重建近端和远端肺上皮，并显示自我更新和多谱系分化达2年，提示基因校正细胞治疗潜力。

8. 结论与未来方向
CRISPR疗法已获批用于镰状细胞病，PE、BE、CRISPRa和CRISPRi等工具不断优化，安全性和脱靶控制改善，但肺递送仍需提升。尽管递送策略进步，肺内治疗潜力仍受复杂结构、递送屏障和器官安全性限制。下一代载体如工程化AAV衣壳和选择性器官靶向纳米颗粒旨在增强趋向性、增加载荷并降低免疫原性；免疫逃逸递送系统对重复给药至关重要。上皮代谢状态影响纳米颗粒摄取，提示递送系统需适应疾病微环境。安全评估方面，诱导DSB的核酸酶可导致脱靶切割、大缺失或染色体重排，对基底细胞、club细胞和AT₂细胞等长寿上皮祖细胞尤为重要；高保真核酸酶、瞬时编辑表达和无DSB平台可降低风险，但需在人源系统中进行基因组完整性评估。人源模型应评估编辑效率、脱靶、炎症和组织毒性，并纳入黏液高分泌、纤维化和代谢改变等疾病特征。未来模型还需纳入性别等生物学差异。编辑工程、递送优化和人源模型验证正在汇聚，未来十年可能迎来首批靶向气道和肺泡上皮的in vivo基因编辑试验，推动慢性肺病治疗变革。