《Viruses》：Bridging the Gap: Challenges and Innovations in Validating Next-Generation Sequencing Discoveries of Arboviruses
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新一代测序（Next-generation sequencing, NGS）极大地加速了从节肢动物媒介中鉴定病毒基因组序列的进程，揭示了潜在虫媒病毒（Arbovirus）前所未有的多样性。然而，这些新发现的病毒基因组序列（Novel viral genomic
新一代测序（Next-generation sequencing, NGS）极大地加速了从节肢动物媒介中鉴定病毒基因组序列的进程，揭示了潜在虫媒病毒（Arbovirus）前所未有的多样性。然而，这些新发现的病毒基因组序列（Novel viral genomic sequences, NVGS）中，绝大多数仍是未经表征的基因组数据，缺乏相应的病毒分离株，这凸显了序列检测与生物学验证之间的脱节。这一差距阻碍了研究人员对这些新发现病毒的生物学特性、宿主范围及致病潜力的理解。为弥合这一鸿沟，本综述倡导整合性策略，包括扩大细胞培养筛选、开发新型细胞系以及应用反向遗传学（Reverse genetics）方法。同时，结合人工智能（Artificial intelligence, AI）进行病毒特性的预测性表征。此外，可将NGS与其他测序策略相结合，以获取更完整、更准确的病毒全基因组序列。验证NGS的发现对于针对新发虫媒病毒威胁进行有效的风险评估和疫情准备至关重要，对公共卫生监测具有重要意义。
论文主体内容总结
1. 虫媒病毒与虫媒病毒相关疾病
本节回顾了虫媒病毒（Arbovirus）的传统研究范式。历史上，通过传统细胞培养技术（如C6/36、BHK和Vero细胞系）或动物模型（如乳鼠和鸡胚）已成功分离出超过500种虫媒病毒，并对其病毒滴度、蚀斑形态、复制动力学等生物学特性及致病性进行了系统研究。以寨卡病毒（ZIKV）、西尼罗病毒（WNV）等为例，这些在1985年前分离的“活病毒”及其积累的生物学数据，在应对2015年南美洲寨卡疫情等新发疫情中发挥了关键作用，凸显了拥有可培养的“活病毒”对于有效应对新发虫媒病毒疫情的重要性。
2. 利用新一代测序（NGS）发现了大量新型病毒基因组序列
本节介绍了利用新一代测序（NGS）技术，如病毒组学（Viromics）和宏转录组学（Metatranscriptomics），在全球范围内从蚊、蠓、蝙蝠和啮齿动物等样本中发现了大量前所未有的新型病毒基因组序列（NVGS）。例如，在巴西Juruá河地区的一项宏基因组调查中发现了超过500条病毒序列。这些海量NVGS极大地丰富了公共数据库，并促使国际病毒分类委员会（ICTV）在2021年对病毒分类进行了重大修订。本节还通过图示概述了基于NGS的NVGS发现与表征的整体流程。
3. NVGS并非新型病毒分离株，且具有固有局限性
本节是论文的核心论述之一，明确指出通过NGS获得的NVGS本质上只是基于序列的证据，而非经过实验验证的病毒分离株。与传统病毒分离方法相比，NVGS无法直接提供关于病毒感染性、宿主范围、复制特性和致病性等关键生物学信息。其局限性体现在：序列通常不完整，多为部分基因组片段；质量高度依赖测序平台和生物信息学分析，易受宿主核酸污染、测序深度不足、读长短以及denovo组装产生嵌合重叠群等问题影响；且缺乏标准化的质量控制流程。因此，研究人员提出了一个风险导向的优先级排序框架，通过四个标准（A.与已知病原体的系统发育相关性；B.暴露潜力；C.宿主范围广度；D.人类或牲畜感染证据）对NVGS进行评分（0-8分），以划分为高、中、低三个优先级，从而合理分配验证资源。同时，作者也强调该评分逻辑仅为概念性辅助工具，并非经过验证的定量工具。
4. 加强对通过NGS发现的NVGS生物学意义的研究
本节强调了加强NVGS生物学意义研究的必要性。鉴于新发传染病每2-3年出现一次，且蚊媒病毒如ZIKV、DENV和CHIKV已造成巨大疾病负担，NVGS可能包含“X疾病”的潜在病原体。例如，最初通过蜱虫宏转录组测序发现的耶佐病毒（YEZV）和坦迪病毒（TAMV），均与高致病性的克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）同属，并已证实或高度怀疑能引起人类发热性疾病。然而，仅靠序列分析无法替代病毒分离株所代表的生物学表型。为此，本节提出了四种互补的研究策略：
4.1 推进病毒分离策略：从传统细胞系扩展到新型培养系统
该策略主张在病毒分离中并行使用哺乳动物细胞系（如Vero、BHK）和昆虫细胞系（如C6/36），以增加获得病毒分离株的几率。同时，强调开发源自人类组织（如肝、肺、肠、神经）的新型细胞培养系统（如类器官）的必要性，以分离具有组织嗜性和人类致病性的病毒。此方法硬件要求低，在资源有限的环境中可行性最高，但存在固有局限，例如当病毒无法在现有细胞系中复制或为低滴度样本时，可能无法获得目标分离株，文中以日本监测中发现的Sarayaka病毒（SAYAV）未能成功分离为例加以说明。
4.2 利用人工智能生成关于“NVGS”所代表病毒生物学特性的假设和推断
本节探讨了在缺乏病毒分离株的情况下，利用人工智能（AI）辅助分析推断病毒生物学特性的价值。文中列举了VirHostPRED（预测人类感染风险）、AlphaFold（预测蛋白质结构）、BFVD和Viro3D（病毒蛋白结构数据库）等工具，表明AI分析能在序列、结构和功能层面提供有价值的初步推断。然而，作者明确指出，AI预测的输出应被视为待检验的假设而非最终结论，其可靠性受限于训练数据覆盖的序列空间，且无法捕捉受体结合、膜融合等动态过程。因此，AI的价值在于为实验验证优先排序，而非取代实验。
4.3 利用反向遗传学技术获得“NVGS”所代表的重组病毒
该策略针对具有重要生物学意义但仅有部分序列信息的NVGS，采用分子病毒学替代系统，如假病毒、复制子、微基因组或嵌合模型。其核心方法是将NVGS的基因元件重组到亲缘关系较近的病毒（如将SBV的结构基因重组到CCHFV的感染性克隆骨架中）的“感染性克隆”中，从而“拯救”出重组病毒。该策略在虫媒病毒领域已得到验证，如利用BAC系统成功构建JEV和ZIKV的全长感染性cDNA克隆。但此方法对专业知识和机构设施要求极高（需BSL-3实验室等），且面临NVGS序列不完整、合成错误、嵌合病毒表型差异以及生物安全和双重用途风险等挑战。因此，应优先用于具有高公共卫生风险的NVGS。
4.4 利用多种测序技术完善NVGS的基因组结构并探究准种多样性
本节指出，病毒在宿主体内通常以准种（Quasispecies）形式存在，但多数NVGS研究仅报告共有序列，忽略了准种水平的异质性。为克服短读长测序的局限，应结合长读长测序技术（如ONT、PacBio）和短读长测序（即混合测序），以解析复杂基因组区域（如ITR、poly(A)尾）并提供变异位点间的连锁信息。此外，靶向富集和合成长读长等策略也能提高病毒序列的回收率。测序策略应根据样本生物学特性（如媒介来源样本通常具有更广泛的宿主内多样性）和具体研究问题进行调整。但测序本身无法验证病毒的感染性或致病性，其作用在于为其他验证策略提供完整的全长基因组，并识别关键功能位点的变异单倍型，从而为功能测试提供特定靶标。
