细胞外囊泡（EVs）来源剪接前导RNA（SL-RNA）作为利什曼病微创检测的分子生物标志物：一项概念验证研究

《Tropical Medicine and Infectious Disease》：Extracellular Vesicle-Derived Spliced Leader RNA as a Minimally Invasive Molecular Biomarker for Leishmaniasis Detection

利什曼病（leishmaniasis）仍是一种主要被忽视的热带病，尤其在可靠诊断仍具挑战的流行区。许多现有诊断方法具有侵入性、敏感性不足，或需要资源有限环境中可能无法获得的设备和专业知识。寄生虫来源的剪接前导（spliced leader, SL）RNA近期作为有前景的分子标志物受到关注，因为其可能实现对存活利什曼原虫（Leishmania）的灵敏检测，并有助于追踪感染随时间的变化。细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）也日益受到关注，因为其保护并运输稳定生物分子，可能提供有价值的诊断信息并影响寄生虫与宿主之间的相互作用。在这项概念验证研究中，研究人员评估了从实验利什曼病模型系统获得的EV富集制备物中检测Leishmania来源SL-RNA的可行性。EV富集制备物采用沉淀法从寄生虫条件培养基（parasite-conditioned media, PCM）、感染THP-1巨噬细胞（infected THP-1 macrophage, I-MP）条件培养基（cell-conditioned medium, CCM）以及实验感染小鼠血清中分离。作为补充分离方法，另一些制备物通过超速离心从PCM中分离。每种制备物的一份等分试样通过纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）分析以确定颗粒大小和浓度，其余部分用于RNA提取。RNA被逆转录为cDNA，并使用定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）分析SL-RNA扩增。在PCM、I-MP CCM和实验感染小鼠血清中成功检测到SL-RNA扩增，而未感染对照未显示特异性扩增。这些发现通过液滴数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）分析独立确认。值得注意的是，来自感染小鼠的EV富集制备物产生的SL-RNA信号强于单独血清，突显了在EV富集人临床样本中靶向SL-RNA的诊断潜力，尤其是在低负荷感染中。尽管这些发现支持EV相关SL-RNA作为Leishmania感染分子生物标志物的可行性，但仍需用人样本进行临床验证。

利什曼病由Leishmania属原虫引起，经感染雌性白蛉叮咬传播，仍是主要全球健康负担，在热带和亚热带、资源有限地区影响脆弱人群。每年有大量内脏利什曼病（visceral leishmaniasis, VL）和皮肤利什曼病（cutaneous leishmaniasis, CL）新病例。准确诊断仍是临床挑战。传统寄生学方法如显微镜、组织活检、脾或骨髓穿刺重要，但具侵入性、需技能，在低寄生虫负荷或慢性感染中敏感性降低。血清学如重组K39抗原快速诊断试验（recombinant K39 antigen-based rapid diagnostic test, rK39 RDT）、间接荧光抗体试验（indirect fluorescent antibody test, IFAT）、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、直接凝集试验（direct agglutination test, DAT）侵入性较小，但敏感性特异性随地区、虫种和宿主免疫状态变化。PCR（polymerase chain reaction）和qPCR（quantitative polymerase chain reaction，定量聚合酶链反应）提高分析敏感性和特异性，但寄生虫死亡后DNA持续可能限制活动感染或治疗反应监测。RNA靶标受关注，尤其SL-RNA（spliced leader RNA，剪接前导RNA），其保守、高丰度、与代谢活跃寄生虫相关。SL-RNA又称mini-exon RNA，是短非编码RNA，参与寄生虫mRNA成熟；Leishmania基因转录为长多顺反子转录本，经反式剪接将带帽剪接前导序列加到每个mRNA的5^′端。该区域在Leishmania种间高度保守，但与相关动质体寄生虫足够不同，可用作泛Leishmania检测靶标。但RNA易降解，直接血或组织检测需合适保存提取。EVs（extracellular vesicles，细胞外囊泡）是脂双层膜界定颗粒，由所有细胞释放，通过传递蛋白、脂质、代谢物和核酸参与细胞间通讯；异质群体在生物发生、大小和分子组成不同。EVs在感染中运输毒力因子、免疫调节分子和调控RNA，改变免疫反应并支持病原存活。在利什曼病中，寄生虫EV及EV富集制备物可递送寄生虫蛋白至巨噬细胞，调节巨噬细胞信号、细胞因子产生和免疫反应。EV富集可能通过浓缩颗粒相关物质并保护RNA免受降解，解决寄生虫RNA不稳定低丰度。培养研究显示L. donovani和L. braziliensis EV制备物含选择性富集的寄生虫来源小RNA，完整囊泡保护RNA货物免受RNase介导降解。血吸虫病证据也显示血清细胞外颗粒富集可改善低丰度寄生虫来源RNA回收。感染L. donovani或L. amazonensis小鼠的EV富集血浆中检测到tRNA和rRNA来源片段，提示感染期间寄生虫RNA可循环。VL患者血浆EV制备物中鉴定到Leishmania来源蛋白，但人样本中寄生虫来源RNA证据有限。上述研究未探讨SL-RNA是否存在于感染宿主细胞或循环生物体液的EV富集制备物中，也不清楚颗粒富集后回收的SL-RNA是否包裹在膜结合囊泡内还是与非囊泡物质共分离。研究人员假设Leishmania来源SL-RNA可在PCM、I-MP CCM和实验感染小鼠血清EV富集制备物中检测，因此开展概念验证研究，用qPCR和ddPCR评估可行性。由于所选SL-RNA靶标在VL和CL相关Leishmania种间保守，该策略作为潜在泛Leishmania检测而非VL或CL特异性检测。该研究评估实验可行性，不建立分析敏感性、诊断准确性或临床效用。

关键技术方法方面，样本来源包括L. tropica（MHOM/AF/87/RUPERT）、L. infantum（MHOM/TR/3/Adana7）、转基因L. donovani（MHOM/SD/62/1S-CL2D）、转基因L. major（MHOM/JL/80/Friedlin）、L. donovani无菌无鞭毛体、T. cruzi（Dm28c）、T. brucei brucei（427 29:13 WT）、人THP-1单核细胞（ATCC TIB-202）及6–8周龄雌性C57Bl/6小鼠；小鼠由University of Notre Dame Friemann Life Science Center繁育饲养，耳皮内接种1×10⁵个L. major metacyclic promastigotes后4–6周采集血清。EV富集采用聚合物沉淀法，并以差速超速离心补充富集；以NTA测粒径和浓度，提取RNA并逆转录为cDNA，用qPCR和ddPCR检测SL-RNA，通过琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序确认扩增子，另设RNase A处理评估抗RNase能力。

3.1 颗粒表征与RNA回收：通过NTA分析汇集的EV富集制备物，多数平均粒径低于约200 nm；NTA仅表征颗粒，不确立囊泡身份或纯度。总RNA从EV富集制备物中回收。
3.2 SL-RNA qPCR标准曲线：用L. donovani cDNA七个四倍系列稀释（约0.20–800 ng/μL）作qPCR标准曲线，Ct从约40.0降至27.2，线性回归为y = 38.41 ? 3.838x，R² = 0.9777，扩增效率82.2%，显示浓度依赖扩增；未建立定量性能或检测限。
3.3 Leishmania SL-RNA在EV富集制备物中的检测：3.3.1 四种Leishmania种及无菌无鞭毛体：从PCM EV富集RNA中检测到SL-RNA，L. donovani（Ld）、L. major（Lm）、L. infantum（Li）、L. tropica（Lt）均检测到；Ct均值分别为23.07 ± 5.28、16.05 ± 0.50、17.46 ± 1.94、22.43 ± 10.46；L. donovani无菌无鞭毛体（LdAA）一个样本Ct = 20.12；M199对照和NTC 40循环无扩增。结果为定性，不跨种比较。3.3.2 感染巨噬细胞EV富集制备物：L. infantum感染THP-1，5次洗后未见完整胞外寄生虫；感染率为68%、48%、42%，平均胞内负荷为2.82、1.69、1.34。三个I-MP EV富集均检测到SL-RNA，Ct为17.29 ± 0.03、27.52 ± 0.60、30.41 ± 0.93；U-MP 40循环无扩增。结果为定性，不推断与感染负荷的定量关系。3.3.3 感染小鼠血清EV富集制备物：3只感染和3只未感染C57BL/6小鼠中，EV富集比匹配血清Ct更低且一致扩增，未感染对照未确定；额外8只感染小鼠血清EV富集检测到SL-RNA，Ct均值28.82–33.36，中位31.19。3.3.4 聚合物沉淀和超速离心EV富集制备物中的RNase抗性SL-RNA：经RNase A处理后信号降低但仍可检测，并与未感染巨噬细胞、新鲜培养基和NTC区分；证明抗RNase暴露，并确认LdAA条件培养基SL-RNA检测；未做膜破坏，不证明位于膜结合囊泡内。
3.4 ddPCR正交确认：I-MP EV富集RNA经ddPCR，PCM为阳性，U-MP和NTC为阴性；三个I-MP和PCM有阳性液滴，U-MP无。结果作为正交确认，不是分析敏感性验证。
3.5 扩增SL-RNA的测序确认：Sanger测序6个克隆来自6个不同生物样本，含预期39 nt Leishmania SL序列，与参考序列100%一致。
3.6 Leishmania SL-RNA测定的交叉反应评估：L. major PCM强且一致扩增，Ct均值16.62 ± 0.23；Tbb和Tc重复Ct比Lm平均信号晚超过22个循环；未预定义阳性阈值，不足以建立分析特异性。

讨论部分认为，该概念验证显示SL-RNA可在EV富集PCM、I-MP和感染小鼠血清中检测；跨四个Leishmania种和不同阶段，对照无目标一致扩增，6个生物样本测序确认，支持该策略的实验可行性。既往SL-RNA作为敏感泛Leishmania靶标，其丰度和与转录关联使其可能标志活动感染。Ct值因未标准化不能跨种、阶段或样本类型比较，结果仅确认可检测。I-MP和感染小鼠血清检测但对照无，与EV富集携带寄生虫和宿主分子诊断潜力一致；但显微镜不能排除残留寄生虫材料，不能将RNA专归因于感染宿主细胞分泌；巨噬细胞Ct变异不能与感染负荷定量关联，仅3个实验且未标准化；未评估小鼠病变大小或寄生虫负荷。物理位置未解决：聚合物沉淀可共分离非囊泡颗粒和RNA-蛋白复合物，NTA不确立囊泡身份和纯度；超速离心也检测到，说明回收不限于沉淀法。RNase A后仍检测到但信号降低，表明抗RNase暴露；因未做RNase加去垢剂处理，不能证明SL-RNA包裹于膜结合囊泡。需形态和标志物表征及有、无膜破坏的RNase处理确认EV货物。RT-qPCR浓度依赖但效率次优，未建立检测限和定量限，Ct仅支持定性检测。ddPCR提供正交确认，优势待评估。既往泛Leishmania SL-RNA测定具特异性，但本研究中Tbb和Tc晚期扩增，未能建立分析特异性；需更广泛交叉反应面板和预定义阳性阈值。血清检测可减少侵入性组织采样；小鼠EV富集血清比直接血清RNA信号更强，提示富集可能改善靶标回收，但初步比较不确立分析或诊断敏感性，需更大标准化样本。当前多步流程需专业设备和人员，低资源地区初期可能在区域分子实验室实施，广泛使用需简化样本制备、稳定试剂和便携或等温扩增平台。局限包括EV表征不完整、RNA产量低且变异、无独立RNA完整性评估和正式分析验证、交叉反应面板有限、无人样本。临床研究应评估确诊VL和CL及健康与疾病对照，与已有诊断方法比较，并评估与寄生虫负荷、疾病严重程度和治疗反应关系。总体支持RNase抗性SL-RNA在EV富集实验制备物中的概念验证检测，但需进一步分析和临床验证方可视为微创诊断生物标志物。

结论翻译：这项概念验证研究表明，Leishmania SL-RNA可在来自实验培养、感染细胞和小鼠样本的EV富集制备物中检测到，ddPCR提供正交确认，测序确认扩增子身份。由于未建立囊泡定位、分析性能和诊断准确性，这些发现未验证SL-RNA作为临床生物标志物。需要进一步分析评估和使用充分表征的人样本的研究，以确定其诊断和治疗监测效用。