《SCIENCE ADVANCES》：Transposon end recognition and pairing by I-F3 CRISPR-associated transposase
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为了开发基于CRISPR相关转座子（CASTs）的基因治疗工具，必须明确转座子末端在转座过程中如何被识别和配对。转座子7（Tn7）样转座子通常包含不对称的左端和右端序列，这些序列侧翼于并限定DNA cargo。然而，转座酶如何识别这些不同序列并将其组装为具有催
为了开发基于CRISPR相关转座子（CASTs）的基因治疗工具，必须明确转座子末端在转座过程中如何被识别和配对。转座子7（Tn7）样转座子通常包含不对称的左端和右端序列，这些序列侧翼于并限定DNA cargo。然而，转座酶如何识别这些不同序列并将其组装为具有催化能力的剪切-粘贴转座状态仍未知。在此，研究人员展示了VchCAST转座酶TnsB与转座子DNA末端及宿主因子IHF（IHF）复合物的冷冻电镜（cryo-EM）结构，并结合生物化学、分子动力学（MD）和体内分析。该结构揭示了组装体的化学计量和架构，以及适应转座子末端不对称性所需的DNA扭曲。分子动力学提示，这些扭曲是复合物协调组装所必需的。不对称左端和右端的物理结合产生了一个此前未被表征的蛋白质-蛋白质界面，该界面为转座效率所必需。研究人员的发现解释了转座酶如何调控转座子末端序列配对以实现高保真识别，揭示了转座子末端突触模型，并提示了为基因组编辑应用工程化DNA cargo的未来途径。
研究背景：转座子是可自主 mobilise于宿主基因组内的DNA片段。II类DDE转座子编码转座酶，催化转座子DNA的切除和基因组整合，即剪切-粘贴转座。转座过程需要转座酶将右端和左端序列突触，并通过多步反应催化链酯化，将供体DNA整合入基因组，且不需要引入细胞毒性双链DNA断裂。转座子末端序列可转移至外源供体DNA，引导大片段DNA cargo整合，使转座子成为有吸引力的基因组编辑工具。但末端序列可达数百碱基对，限制供体DNA cargo序列。Sleeping Beauty、IstA/B和Mos1等转座子具有对称末端；具有不对称末端的转座子左右端转座酶结合位点的数量、方向和间距不同，可提供额外调控并维持供体DNA插入方向，但缺少结构解释不对称末端如何被组装容纳。DDE转座酶催化核心结构信息较多，类似逆转录病毒整合酶，组装为二重对称复合物。Tn7样转座子及其远缘同源物MuA的催化核心为二重对称同源四聚体。某些Tn7样转座子中TnsA切割5′端，产生简单插入。Tn7样转座子具有位点特异性，Tn7本身右端有四个部分重叠TnsB结合位点，左端有三个分离位点。近期Tn7 TnsB结合右端DNA的cryo-EM结构显示平铺寡聚组装，不同于催化核心，提示转座早期可能形成不同组装。CASTs是近期发现的Tn7样转座子，依赖CRISPR样效应器和TniQ，而非序列特异性DNA结合蛋白。I-F3 CAST家族具有显著on-target整合特异性，可用于微生物菌株工程和潜在临床基因治疗。研究人员旨在确定Vibrio cholerae TnsB（VchCAST）如何识别其不对称转座子末端，该末端对于on-target供体DNA整合必需。该转座子左端有三个20 bp TnsB结合位点不均匀间隔（LE1至LE3），右端三个（RE1至RE3），除RE3外均需活性；LE1和LE2间有保守IHF结合位点，IHF刺激转座一个数量级但机制未知。该研究发表于《SCIENCE ADVANCES》。
关键技术方法：体外重构含最小转座子末端序列的链转移底物，模拟Shapiro中间体/整合产物，与VchCAST TnsB和IHF组装复合物；单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）解析结构，局部精修构建复合图，结合AlphaFold模型建模；电泳迁移率变动分析（EMSA）测定各TnsB结合位点亲和力；分子动力学（MD）模拟分析IHF、突变及界面稳定性；在E. coli BL21和PO603供体菌株中进行Mate-in体内转座实验，其中PO603由J. E. Peters赠送。无临床样本队列。
研究结果：
1. Asymmetric architecture of the VchCAST strand-transfer complex（VchCAST链转移复合物的不对称架构）：研究人员用VchCAST TnsB、IHF及左右转座子末端重构核蛋白复合物，DNA底物含最小WT转座活性序列（右端RE1和RE2，左端LE1、LE2、LE3），设计为捕获链转移样组装。单颗粒cryo-EM获得3.9 ?结构，含四个TnsB亚基和一个IHF二聚体，局部分辨率约3.7至10 ?。四聚体有两个不同半部分：不对称半（末端识别）结合RE2和LE2，另一半二重对称对应催化核心，类似其他链转移复合物（STC）结构。IHF使DNA弯曲180°，将LE2定位以与TnsB-LE2的N端DNA结合域DBD1和DBD2相互作用；该显著扭曲是LE2可接近蛋白所必需。空间排列和相位提示TnsB对LE2识别对其位置高度敏感，与改变LE间距时保持转座效率需10 bp周期性一致。TnsB-RE2的DBD1结合RE2在图中可见，但局部分辨率8.0至9.0 ?且区域小，未建模。因提供链转移DNA底物，预期看到目标DNA密度，但密度弱，仅可靠追踪至靶位点重复（TSD）起始；TnsA或TnsC已知与Tn7 TnsB相互作用，未来工作应鉴定额外调控机制。供体DNA左右端均有超出IHF的扭曲：左端DNA在IHF与LE2间弯曲约34°，为IHF和TnsB-LE2同时占据位点所需，因理想B型DNA会空间冲突；该扭曲与DBD1和DBD2足迹一致。与Tn7转座酶结合右端DNA结构比较，N端DNA结合域折叠和DNA结合模式相似，但DNA路径显著不同，提示DNA扭曲依赖周围环境而非TnsB-DNA相互作用细节。
2. A previously unidentified TnsB intersubunit interface formed through IHF-induced DNA distortions（由IHF诱导DNA扭曲形成的先前未鉴定的TnsB亚基间界面）：结构中左右端物理接近，在LE2和RE2末端交叉。该排列部分由TnsB-LE2和TnsB-RE1的DBD1域相互作用介导，涉及Val78的疏水堆积。该位置在近缘同源物中不严格保守，但突变显著降低整合活性；V78D和V78K导致转座活性降低10倍，类似IHF缺失。MD模拟显示V78K因正电侧链静电排斥使TnsB-LE2和TnsB-RE1解离，直接解释活性降低；V78D通过附近精氨酸补偿保留局部接触，但扰动远端界面，尤其TnsB-LE2与TnsB-LE1。V78K选择性破坏TnsB-LE2/TnsB-RE1界面，V78D扰动远端。无IHF重构复合物2D类平均显示二重对称组装，与模拟的VchCAST TnsB结合两个右端的对称化版本一致，符合两个右端仍支持低水平转座而两个左端不行的数据。MD模拟左端DNA单独有/无IHF：IHF维持cryo-EM中急剧弯曲构象，去除IHF后DNA快速松弛为直构象；无IHF时DNA碱基失去锚定相互作用，动力学增加，根均方偏差（RMSD）值更高。在复合物中，无IHF导致TnsB-LE2的DBD区域残基100至190柔性增加，左端DNA稳定性降低。这些结构、生化和计算结果表明，TnsB-TnsB界面的有效形成需要IHF诱导左端DNA预先组织成弯曲构象。
3. Base-specific interactions explain position-specific sequence constraints（碱基特异性相互作用解释位置特异性序列约束）：转座酶对其末端有特异性。先前大规模突变显示VchCAST转座子末端每个TnsB结合位点第6至9位和第13位核苷酸重要。结构显示第6、9、13位核苷酸可与DBD1-DBD2连接区残基形成碱基特异性氢键；该连接区类似Mos1转座子末端识别中的AT-hook基序。R118A或R121A突变几乎完全消除转座活性。叠加TnsB-LE1、LE2和RE1该区域链显示结构相似，支持这些要求适用于所有TnsB结合位点。先前Tn7研究表明结合亲和力差异决定转座酶结合顺序。EMSA显示VchCAST TnsB对所有结合位点亲和力相似，解离常数（K
d）约2 nM，与所有DNA结合域在各自位点上结构相似一致。因此，至少对该CAST系统，突触复合物组装并非由结合位点内在亲和力差异驱动。
讨论总结：结构显示内部转座子结合位点可同时被占据并支持催化核心形成，由IHF诱导DNA扭曲促进。TnsA非末端配对必需且不在结构中；未看到所有必需转座子结合位点全占据。基于发现，研究人员提出模型：IHF诱导DNA扭曲驱动形成交叉稳定的TnsB界面，突触转座子末端，V78作为分子“订书钉”锁定整合能力状态。细胞IHF浓度高足以占据左端位点。DNA扭曲使转座酶二聚体协作结合LE1和LE2；右端RE1和RE2排列也促进TnsB二聚体协作结合。结合第一个位点的催化域在二聚体构型中可能灵活，使催化四聚体在突触后形成特征“交换”构型。突触排列中N端DBD接近形成交叉稳定相互作用，固定组装并防止可逆解离。无IHF时四聚体仍可形成，但MD提示更不稳定且活性低于左右端配对。催化核心组装是供体DNA切割前提，随后基因组整合cargo。左端第三个转座酶结合位点虽需活性，但结构中未占据。讨论还指出转座酶不交叉动员其他转座子，I-F3 CAST家族左右端配置相似，转座酶结构一致显示很少序列特异性接触，提示特异性并非来自直接相互作用；供体DNA几何和结合位点布置决定允许构型；特异性弱编码于单个位点但强编码于全部位点；可重新设计末端序列保留高转座活性，增加cargo灵活性并实现精确框内编辑。I-F3 CAST亚家族观察到的末端配置似保守；IHF不刺激Tn7转座，HU对Mu转座子末端配对重要。AlphaFold3未能预测整体架构和未知相互作用。进一步工作需定义末端配对分子要求并改进计算建模。
研究结论翻译：转座酶不交叉动员其他转座子，即使近缘转座子也不交叉动员，表明转座子末端识别必须极其严格。然而，I-F3 CAST家族成员在其右端和左端具有相似的转座酶结合位点配置，提示所有I-F3同源物采用相似架构。此外，转座酶结构一致显示极少数序列特异性接触，提示序列特异性并非源于与转座子末端DNA的直接相互作用。那么，是什么赋予转座酶对其相关末端的精细特异性？研究人员的观察通过提出以下观点解决了这一悖论：转座酶本身的结构或与任何单个转座酶结合位点的特异性相互作用均不足以实现转座子末端识别。相反，研究人员提出，供体DNA本身的几何结构连同转座酶结合位点的位置决定组装的“允许”构型。这些约束对完整转座子序列的依赖性较弱，因此可能经历显著重配置，同时仍支持稳健的整合活性和特异性。由此产生的DNA扭曲可能由AT-hook样基序的协调作用诱导。研究人员得出结论：特异性弱编码于单个转座酶结合位点，但强编码于所有结合位点。此外，生产性突触的结合位点布置受到DNA自身结构施加的约束。该模型提示：(i) 通过整合先验结构信息可改善转座子末端鉴定；(ii) 转座子末端序列可被广泛重新设计而保留高转座活性，从而增加cargo DNA灵活性并实现精确的框内编辑。
