改进的Click Display平台实现蛋白质结合物的快速富集与亲和力成熟

《Protein Engineering, Design and Selection》：Rapid selection of high-affinity DARPins using click display

摘要

快速且可扩展的蛋白质结合物发现平台对于加速治疗和诊断开发至关重要。Click display是一种无细胞蛋白质展示技术，可在2小时内的单罐反应中将新生蛋白质与其编码cDNA共价连接，从而实现快速体外筛选。尽管此前已证明其支持定向进化，但在生物筛选过程中的富集效率比传统噬菌体展示要慢。在此，我们报告了两种显著增强click display筛选效率的改进：(i) 使用可切割的生物素连接子选择性洗脱靶标结合的复合物，以及(ii) 使用生物素化的封闭蛋白竞争性置换非特异性珠结合物。这些改进大幅减少了对非特异性结合物的扩增，并使得能够在三到四轮筛选内高效富集靶标特异性结合物。使用初始DARPin文库，我们快速富集了针对白介素-10（IL-10）和转化生长因子-β1（TGF-β1）的结合物，并鉴定出具有低纳摩尔级结合亲和力以及受体阻断活性的克隆。我们进一步将优化后的方案应用于PD-L1结合DARPin的亲和力成熟，实现了超过400倍结合亲和力的提升。最佳候选分子1D10在竞争ELISA中表现出亚纳摩尔级的PD-1抑制活性。这些结果表明，优化后的click display工作流程能够实现高亲和力DARPin在多种靶标上的快速富集和亲和力成熟。该平台提供了一种简化的、无需转化的方法来加速蛋白质工程和定向进化。