DeCoRE：基于直接RNA测序（direct RNA sequencing, DRS）利用误读碱基增强结构信号并直接聚类读段以解析RNA结构异质性与动态性的计算方法

《SCIENCE ADVANCES》：DeCoRE: A computational method to resolve RNA structural heterogeneity from RNA structure probing data by direct RNA sequencing

RNA分子具有内在动态性，可形成由替代构象组成的复杂结构集合以指导细胞功能。当前用于解析RNA结构异质性与动态性的方法多基于短读长测序（short-read sequencing）结构探针数据，灵敏度和分辨率受限。研究人员提出DeCoRE（deconvolving complex RNA structural ensembles），一种利用直接RNA测序（direct RNA sequencing, DRS）在单个转录本水平解析RNA结构异质性与动态性的计算方法。DeCoRE将增强的结构信号检测与测序读段直接聚类相结合，以单核苷酸分辨率灵敏地去卷积RNA结构集合。研究人员通过解析赖氨酸（lysine）和TPP核糖开关（riboswitch）的已知替代构象，并揭示细菌核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA）此前未表征的共转录折叠路径，证明DeCoRE能力：早期延伸阶段两种构象共存，随后渐进收敛为单一成熟构象。DeCoRE是解析RNA结构异质性与动态性、推进RNA功能理解的强有力工具。

研究背景方面，RNA分子通过形成复杂二级与三级结构参与催化和调控，其结构具有动态性和构象可塑性。传统高通量RNA结构探针利用DMS、SHAPE试剂（如NAI）修饰未配对或柔性核苷酸，再通过深度测序推断结构，但只能得到结构集合的平均结构，掩盖构象异质性。现有RING-MaP、DREEM、DRACO、DANCE-MaP等工具面向短读长平台，受读长限制；长读长DRS方法如PORE-Cupine、nanoSHAPE、Nano-DMS-MaP、smStructure-seq虽可测全长，但因探针修饰率低、单读段结构信号稀疏，难以在单个转录本内解析异质性，DaVinci等先预测每读段结构再聚类的策略也受稀疏信号影响。论文发表于《SCIENCE ADVANCES》，研究人员开展DeCoRE方法学开发与实验验证，结论是：把DRS中被忽视的误读碱基作为结构约束信号，并对读段原始结构特征直接聚类，可在单转录本、单核苷酸水平高分辨解析RNA构象集合与共转录折叠动态。

主要关键技术方法方面，数据来自公开DRS结构探针数据集及研究人员构建的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）16S rRNA转录中间体体外文库；方法包括用Nanopolish将FAST5原始电流信号比对参考并归并为事件，以一类支持向量机（one-class SVM）融合电流均值、标准差和对数驻留时间识别修饰碱基，并把不能与参考对齐的误读碱基纳入增强结构谱；将每读段编码为匹配=0、修饰=1、误读=2的向量，经UMAP降维后以高斯混合或DBSCAN聚类，按簇计算反应性评分（reactivity score），再用RNAfold加反应性约束预测簇特异结构模型。

研究结果部分，DeCoRE enhances RNA structural information retrieval from DRS probing data：研究人员用pri-miR-17～92a已知结构评估，发现误读碱基频率中位数9.6%，高于修饰碱基2.1%，且与修饰信号相关；一类SVM联合三种电流信号并整合误读碱基与修饰碱基取得最高AUC=0.820，优于PORE-Cupine、nanoSHAPE、Nanocompore，且在Guppy与Dorado不同basecaller下稳定。DeCoRE resolves known and previously uncharacterized RNA structural heterogeneity：在lysine riboswitch得到两个簇，分别对应抗终止与终止构象， silhouette score=0.72；TPP riboswitch得到两个簇对应ON/OFF态，silhouette score=0.77；剔除误读碱基则所有读段坍缩为单簇，DaVinci聚类虽有两簇但结构吻合差。SARS-CoV-2 sgRNA N分析发现平均结构掩盖异质性，两簇差异主要在3′UTR。DeCoRE uncovers structural transitions during 16S rRNA transcription at single-nucleotide resolution：按3′端10 nt分辨率将读段分为136个中间体，与全长反应性评分PCC低；单核苷酸轨迹显示84%位点发生结构转换，G162由非配对错配渐成碱基对，C192由茎区熔解为环，G178多次在配对与非配对间转换。DeCoRE uncovers structural conformational dynamics during 16S rRNA transcription：高覆盖的5个中间体中，早期三个各解析出两构象C1与C2，后期两个仅单构象；PCA显示C1更热稳且随延伸占优，C1与C2通过3′端重排渐进收敛为成熟单构象。

讨论部分总结：研究人员指出DeCoRE有两方面创新，一是把外源探针导致的误读碱基用作结构信息，二是直接聚类原始数字结构签名，避免逐读段建模型带来的误差与偏差。该方法借助DRS长读长能力，揭示rRNA共转录早期可塑、后期3′端重排收敛的折叠路径，对核糖体生物发生中装配因子与核糖体蛋白瞬时结合具有解释力。局限性在于误读可能含非结构测序错误，高错误率会削弱分类；R10.4等新flow cell可降本底；体外3′端多样化中间体不能完全复现体内转录速度、RNA结合蛋白等复杂因素。

研究结论部分翻译：DeCoRE通过协同纳入误读碱基以增强结构信号检测，并直接聚类原始测序读段以改善构象集合分辨率，从基于DRS的结构探针数据中对RNA结构异质性与动态性进行单转录本水平解析。DeCoRE在重建已知与先前未鉴定RNA构象上优于现有DRS结构探针流程。其直接聚类策略保留了观测到的构象多样性，避免过早结构赋值造成的信息损失与模型偏差。依托DRS长读长能力，DeCoRE揭示16S rRNA共转录折叠中早期两构象共存、后经3′端重排收敛为单一热力学稳定成熟折叠的路径，补充并扩展了短读长研究。该动态构象收敛可能支撑新生rRNA与装配因子及分子伴侣相互作用，促进核糖体发生。DeCoRE为在多类生物系统中研究RNA功能、调控与进化的结构基础提供了通用且高分辨的平台。