多组学分析揭示6PPDQ暴露巨噬细胞中氧化应激相关的甘油磷脂代谢和炎症反应改变

《Environmental Pollution》：Multi-omics analysis reveals oxidative stress-associated alterations in glycerophospholipid metabolism and inflammatory response in 6PPDQ-exposed macrophages

　　

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  6PPDQ暴露诱导RAW 264.7巨噬细胞发生氧化应激驱动的细胞毒性。
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  多组学分析鉴定甘油磷脂代谢为关键受损通路。
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  LPA积累和Gpat3/Lpar2上调将脂质改变与炎症联系起来。
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  6PPDQ激活NF-κB信号通路并升高TNF-α、IL-6和iNOS的表达。
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  NAC预处理可减轻ROS、脂质改变和炎症反应。

引言

轮胎磨损颗粒是环境中新污染物的重要来源。在轮胎使用和老化过程中，添加剂被释放并可转化为更具反应活性的化合物。其中，N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基-p-苯二胺醌（6PPDQ），是N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基-p-苯二胺（6PPD）的转化产物（Hua and Wang, 2023a），因其毒性以及在环境介质中的广泛存在而受到越来越多的关注（Cao et al., 2022a; Zeng et al., 2023; Zhang et al., 2022）。近期研究揭示，6PPDQ广泛存在于大气、陆地和水体环境中，表明环境暴露并不局限于单一介质或途径（Cao et al., 2022b, a; Zeng et al., 2023; Zhang et al., 2022）。特别地，城市径流是轮胎来源的6PPDQ从路面进入水环境的重要途径，而道路灰尘和空气颗粒物则可能贡献陆地和吸入暴露（Li et al., 2026b）。在不同环境介质中，6PPDQ根据其暴露途径和目标物种表现出不同的毒性特征（Li et al., 2024）。例如，环境监测显示其在城市径流中的浓度可达19 μg/L（Tian et al., 2021b）。在水生生物中，6PPDQ被确定为导致虹鳟鱼与暴雨径流相关的急性死亡的主要原因，其中位数致死浓度（LC₅₀）为0.8 ± 0.16 μg/L，这表明即使在极低浓度下也具有高度毒性（Tian et al., 2021b）。然而，现有的现场证据表明6PPDQ在某些水生生物中以痕量水平存在，例如鱼类、虾和海参（<0.17–0.26 ng/g湿重）以及贻贝（<1 ng>

6PPDQ在动物模型中表现出跨多器官的系统毒性，包括免疫毒性（Yang et al., 2026）。在秀丽隐杆线虫中，6PPDQ暴露诱导免疫抑制，伴随抗菌基因表达降低、活性氧（ROS）产生增加和跨代免疫效应（Wang and Wang, 2024; Wu et al., 2024）。6PPDQ在小鼠模型的多个器官（包括肝脏、肺和肠道）中诱导系统性炎症损伤（Fang et al., 2023; He et al., 2024; Yang et al., 2024）。此外，6PPDQ通过巨噬细胞驱动的过度炎症加重了小鼠模型中的病毒免疫病理（Qiu et al., 2026）。这些发现表明巨噬细胞可能参与介导6PPDQ的免疫毒效应。作为前线吞噬细胞和高度可塑的固有免疫细胞，巨噬细胞整合来自外来化学物质和组织微环境的信号，并将这些信号转化为多样的炎症、氧化和代谢反应（Murray et al., 2014; Wynn et al., 2013）。巨噬细胞能够快速响应外部刺激，并通过释放细胞因子调节炎症（Murray and Wynn, 2011）。巨噬细胞表现出显著的功能可塑性，其激活状态受多种因素调节，包括微环境刺激和代谢紊乱，这些因素进而塑造炎症反应的强度和方向（Locati et al., 2020; Sica and Mantovani, 2012）。在强烈或持续刺激下，巨噬细胞可能出现功能失衡，包括过度炎症或免疫调节受损（Chen et al., 2023; Hamidzadeh et al., 2017; Tian et al., 2021a）。这使得巨噬细胞成为研究6PPDQ是否直接干扰巨噬细胞功能的一个实验上可行且具有生物学相关性的模型。然而，6PPDQ对巨噬细胞的影响及其潜在的细胞机制在很大程度上仍未被阐明。

越来越多的证据表明，氧化应激与化学物质诱导毒性过程中的巨噬细胞功能障碍密切相关。氧化应激主要以过量的ROS产生为特征，是化学物质诱导细胞损伤的关键机制（Sies, 2015）。过量的ROS可损害线粒体功能并扰乱细胞能量代谢，从而改变正常的细胞活动（Cheng et al., 2025; Li et al., 2022）。先前研究表明6PPDQ可在不同模型中增加ROS水平（Anderson-Bain et al., 2023; Wang and Wang, 2024; Wu et al., 2024），但其在巨噬细胞中的作用尚不清楚。甘油磷脂是细胞膜的主要组成成分，对维持膜完整性和生物功能至关重要（Van Meer et al., 2008）。除了结构作用外，甘油磷脂还作为花生四烯酸的重要储存库，并参与炎症脂质介质的生物合成（Bermúdez et al., 2022; Dennis, 2000）。溶血磷脂酸（LPA）是甘油磷脂代谢的活性产物，可通过与特异性细胞表面受体结合激活多个下游信号通路（Moolenaar, 1995）。在氧化条件下，过量的ROS可诱导磷脂氧化并生成氧化磷脂，从而改变膜特性并扰乱细胞信号传导（Bochkov et al., 2010; Fruhwirth et al., 2007）。此外，甘油磷脂代谢的紊乱可能改变脂质组成并损害膜稳定性，导致细胞功能障碍和炎症激活（Li et al., 2025）。基于这些发现，有必要在细胞水平研究6PPDQ对巨噬细胞的影响。

本研究使用RAW 264.7巨噬细胞作为体外模型，在受控条件下研究6PPDQ暴露的直接效应，而非与不同环境介质或暴露途径相关的毒性。本研究采用多组学方法分析代谢和转录变化，并使用抗氧化干预评估氧化应激的作用。本研究旨在为6PPDQ诱导毒性的机制提供见解，并支持进一步的风险评估。

各节摘要

试剂

6PPDQ（纯度≥98%，CAS No. 2754428-18-5）购自郑州阿法（中国郑州）。二甲基亚砜（DMSO）和N-乙酰半胱氨酸（NAC）购自阿拉丁（中国上海）。针对磷酸化NF-κB p65（Ser536）、NF-κB p65、Lamin B1和GPAT3的一抗购自Cell Signaling Technology（美国Danvers）。LPAR2抗体购自Novus Biologicals（美国Centennial）。GAPDH和HRP偶联山羊抗兔IgG购自Proteintech

6PPDQ对巨噬细胞的细胞毒性效应

首先使用CCK-8法评估细胞活力。经24小时暴露后，6PPDQ（0–4000 μg/L）以浓度依赖的方式降低RAW 264.7巨噬细胞的活力（图1A和图S1）。根据剂量-反应曲线，24小时和48小时的IC₅₀值分别计算为3876 μg/L和1376 μg/L。采用24小时暴露期作为后续所有实验的观察窗口。基于此结果和已报道的最高环境浓度

讨论

6PPDQ已在环境介质中被广泛检测到，其在哺乳动物中的毒性效应受到越来越多的关注。目前大多数研究聚焦于肝损伤（Yeisley et al., 2025; Zhang et al., 2025）、神经毒性（Blair et al., 2021; Fang et al., 2024; Liao et al., 2024）或肺毒性（Hyman et al., 2025; Wang et al., 2025），而关于免疫细胞的信息仍然有限。作为固有免疫的关键效应细胞，巨噬细胞易于对外源性化学应激作出反应并

结论

总之，6PPDQ在RAW 264.7巨噬细胞中诱导了明显的细胞毒性效应，其特征为氧化应激增强、膜损伤、炎症激活、线粒体膜电位丧失和细胞凋亡增加。多组学分析进一步揭示了甘油磷脂相关代谢谱的显著改变，同时TNF和NF-κB相关炎症通路显著富集。NAC干预在一定程度上缓解了这些变化，

CRediT作者贡献声明

张文杰：撰写——初稿、可视化、方法学、调查、正式分析、数据整理。陈佳乐：撰写——审阅与编辑、可视化、验证。王琦：撰写——审阅与编辑、方法学。景琦：撰写——审阅与编辑、调查、数据整理。杨美玲：撰写——审阅与编辑、数据整理。马安平：撰写——审阅与编辑、调查。吴邦华：撰写——审阅与编辑、监督、方法学、资助获取，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

数据可用性

所有数据可根据要求提供。

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致谢

我们感谢中国广东省自然科学基金（项目编号：2026A1515012885）和广东省医学科研基金（项目编号：A2025148和A2026016）提供的资金支持。我们感谢上海SCIEX分析仪器贸易有限公司程龙博士（中国上海200335）在靶向代谢组学分析方面提供的帮助。

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