由不同物种来源的P450酶催化的苯胺消毒副产物代谢激活机制研究：N-羟基化机理洞察

《Environmental Pollution》：Mechanistic insight into Metabolic Activation Mechanism of Aniline Disinfection Byproducts catalyzed by P450 Enzymes from Distinct Species: N-hydroxylation Mechanism

　　

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  OH回弹步骤被确定为N-羟化反应的速率决定步骤。
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  建立了一种QSAR模型，用于预测OH回弹步骤的能量壁垒。
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  斑马鱼P450在接触AN-DBPs时最易发生代谢活化。
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  与原始AN-DBPs相比，其代谢产物表现出增强的毒性效应。

引言

消毒副产物（DBPs）是在饮用水处理过程中由消毒剂与有机/无机物质反应生成的，对饮用水安全构成了重大隐患（Wang等，2017；Zhang等，2026）。自污染物鉴定方法问世以来，已检测出超过800种DBPs（Chen等，2024）。DBPs广泛存在于地表水样品（Liu等，2020）、饮用水（Chen等，2024）、游泳池水（Mian等，2018）和土壤（Xu等，2008）中。在已鉴定出的数百种DBPs中，苯胺类DBPs（AN-DBPs）因其普遍性和毒性而尤其值得关注（Ma等，2025）。在广泛的水环境中，AN-DBPs的浓度从ng/L到μg/L不等（Liu等，2020）。鉴于AN-DBPs以如此高的浓度广泛存在，它们有可能通过各种途径进入人体，对健康构成直接威胁（Li等，2025）。DBPs已在一般人群的血清、脂肪、精液和尿液样品中被检测到（Wang等，2019）。近期研究表明，AN-DBPs往往比当前受监管的DBPs具有更高的毒性，且能对其他生物体造成显著的有害影响（Hu等，2022；Lou等，2023）。一项最新研究发现，接触AN-DBPs会显著增加大鼠脾脏间充质肿瘤的发病率（Zhang等，2022）。AN-DBPs在体外表现出明显的细胞毒性，提示其对生物体存在潜在风险（Pizon等，2009）。因此，全面了解AN-DBPs在生物体内的代谢机制，对于减轻环境风险和保障人类健康而言刻不容缓。

近年来，生物技术作为一种可扩展的、以生物驱动的DBPs转化方法，引起了广泛关注（Yang等，2019；Zheng等，2025）。生物技术方法的关键在于酶效率（Lee等，2024；Wang等，2024）。先前的实验研究表明，含氮DBPs可通过基于酶的生物转化方法从自然生态系统中消除（Wang等，2024a；Wang等，2024b），并提出了一种生物转化机制（图S1）。该机制涉及细胞色素P450酶（CYPs）初始N-羟化，生成芳香羟胺中间体，该中间体对毒性结局和代谢终产物谱具有关键影响。随后，芳香羟胺中间体可经历三种不同的代谢途径：（i）在氧化酶作用下氧化形成硝基苯衍生物；（ii）在CYPs作用下生成活性亲电中间体（亚硝鎓离子）（Naiman等，2011）；（iii）在还原酶作用下还原为苯胺衍生物（Ali等，2025）。AN-DBPs的CYPs催化N-羟化初始机制已被证明是一条重要的代谢途径，凸显了其在理解AN-DBPs毒性中的关键作用。然而，迄今为止，CYPs催化AN-DBPs代谢的精确机制仍知之甚少。为了评估AN-DBPs的风险，需要在分子水平上阐明其生物转化途径，从而更好地识别代谢产物并为健康风险评估提供依据（Guengerich和MacDonald，2007）。

作为广泛分布于所有生命域的单加氧酶超家族，CYPs可促进超过20种独特反应类型的海量底物的生物转化（Meunier等，2004；Ortiz De Montellano，2010；Fasan，2012；Rendic和Guengerich，2015；Guengerich，2018；Mirzaei等，2021；Fansher等，2024）。N-羟化在这些反应中排名前列，是最重要的氧化途径之一。先前研究发现，N-羟化机制是芳香胺衍生物的一种生物活化途径（Ji和Schüürmann，2013；Zhang等，2022），被认为是引发致突变性和致癌性的关键步骤（Kim和Guengerich，2005；Tajima等，2020）。相应地，P450催化的AN-DBPs的N-羟化也作为一种生物活化途径发挥作用（Rai等，2023）。相反，P450催化的竞争性C-羟化通常产生酚类代谢产物，这些代谢产物易于结合并排泄，因此代表了一条解毒途径而非活化途径（Bock等，1987；Iyanagi，2007）。此外，鉴于伯芳香胺的N-H键解离能（约88-92 kcal/mol）远低于芳香C-H键的解离能（约110-113 kcal/mol），使得CYPs催化的N-羟化在热力学和动力学上远比C-羟化有利（Blanksby和Ellison，2003；Luo，2007），这与实验观察到的N-羟化产物多于C-羟化产物的结果一致（Li等，2016）。然而，不同物种中各类CYPs介导的AN-DBPs的N-羟化机制在很大程度上仍未被阐明，尤其是这些化合物持续存在的生物学和环境基质中，包括人体细胞、鱼类、细菌和植物。在本研究中，选择CYP 3A4家族代表人类CYPs（Basheer和Kerem，2015），选择斑马鱼CYP 3C1家族代表斑马鱼CYPs（Yang等，2023），选择来自P. putida的CYP 101A1家族作为细菌CYPs的代表（Zhang等，2018），选择拟南芥CYP 97A3家族代表植物CYPs（Niu等，2020）。选择这些CYP亚型作为模型代表的理由在正文S1中进行了详细说明。

为了表征不同物种中CYPs对AN-DBPs的生物活化机制，本研究采用量子化学方法研究了催化机制。开发了一种协同策略，如图1所示：（i）通过高通量密度泛函理论（DFT）方法模拟AN-DBPs的N-羟化代谢并计算活化能；（ii）通过机器学习集成的定量结构-活性关系建模（ML-QSAR）方法建立预测模型，以预测速率决定步骤的能量壁垒；（iii）通过量子力学/分子力学（QM/MM）方法计算四种不同CYPs对AN-DBPs速率决定步骤的活化速率；（iv）通过计算机模拟方法预测AN-DBPs及其代谢产物的潜在毒性效应。该策略阐明了AN-DBPs的生物活化机制，并首次提供了其P450催化N-羟化机制的理论见解。研究结果为进一步阐明P450酶催化的AN-DBPs代谢活化机制以及评估大量DBPs的人类健康和环境效应提供了一份路线图。

章节摘要

高通量DFT计算

按照标准方法，采用六配位氧化铁氧复合物 Fe⁴⁺O^2-(C₂₀N₄H₁₂)^-1(SCH₃)^-1 来模拟CYPs的化合物I（Cpd I）的催化中心。先前的综述提出，使用-SH配体来代表完整的半胱氨酸部分在建模中具有一定优势（Shaik等，2005）。相比之下，-SCH₃部分的电离势与完整的半胱氨酸残基相当，并且能够更好地表征其空间位阻

Cpd I催化的AN-DBPs的N-羟化机制

为了阐明Cpd I催化的N-羟化详细机制，选择2,6-DCA作为模型底物。低自旋（LS）和高自旋（HS）途径的能量轮廓和优化的结构分别如图1所示，优化稳定点的关键键距总结在表S1中。N-羟化反应从反应物复合物（^2,4RC）开始，其特征是2,6-DCA的芳香氨基与Fe=O之间形成氢键相互作用

结论

本研究利用DFT计算、QSAR建模和QM/MM模拟阐明了不同物种P450酶对AN-DBPs的N-羟化机制。本研究的主要发现如下：（1）高通量DFT计算详细阐明了Cpd I介导的AN-DBPs的N-羟化机制，确定了OH回弹过程为速率决定步骤。（2）建立了一种机器学习集成的QSAR模型来预测能量壁垒

CRediT作者贡献声明

Wenxing Wang： 监督。Guibin Jiang： 监督。Zijian Wang： 撰写——原稿，方法论，调查研究，数据整理，概念构思。Jianjie Fu： 撰写——原稿。Wenxiao Pan： 方法论。Qingzhu Zhang： 验证，资源，项目管理。Aiqian Zhang： 监督

未引用参考文献

O Brien，2007；Zhang等，2022。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些情况可能影响本论文中报告的工作。

致谢

本研究获得国家自然科学基金资助（项目编号22206109）

Zijian Wang|Wenxiao Pan|Jianjie Fu|Aiqian Zhang|Qingzhu Zhang|Wenxing Wang|Guibin Jiang