《Current Research in Microbial Sciences》：Biases in High Throughput Sequencing Methods Affect Microbial Molecular Ecology Networks and Keystone Taxa Identification in the
Cinnamomum migao Rhizosphere and Phyllosphere
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在自然界中，附生微生物与其寄主植物之间存在着密切的关系。健康的微生物-寄主互作在促进植物生长发育、提高生产力以及保护植物免受病原微生物侵害方面发挥着至关重要的作用（Bowman and Arnold, 2021）。在长期的协同进化历史中，植物与微生物已形成了一
在自然界中，附生微生物与其寄主植物之间存在着密切的关系。健康的微生物-寄主互作在促进植物生长发育、提高生产力以及保护植物免受病原微生物侵害方面发挥着至关重要的作用（Bowman and Arnold, 2021）。在长期的协同进化历史中，植物与微生物已形成了一个紧密互联的共生体，其中根际和叶际微生物群落最具代表性，分别象征着植物地下和地上的微生态系统（Bashir et al., 2022；Compant et al., 2025；Sohrabi et al., 2023）。这些微生物群落与其寄主之间的共生互作网络贯穿于植物的整个生命周期，容纳了多样化的功能微生物——包括病原体、共生体和分解者——它们形成了稳定的微生物生态网络（MENs），深刻影响着微生物群落动态和寄主生产力（Zeng et al., 2024）。在生态系统层面，这些互作影响寄主植物的健康和养分循环过程，而微生物MENs的形成受多种因素驱动，包括寄主植物分泌物、pH值、降雨和辐射等（Li et al., 2023）。尽管叶际与根际微生物群落之间存在差异，但两者均显著影响植物健康和环境胁迫适应。尽管学术界早期已认识到根际-叶际微生物MENs的重要性，但涉及这些复杂微生物群落的生态过程在很大程度上仍属未知——常被称为科学认知中的“暗物质”（Bao et al., 2020）。
近年来，扩增子测序（amplicon sequencing）、绝对扩增子测序（absolute amplicon sequencing）、2bRAD-M和宏基因组学（metagenomics）等技术为探索叶际和根际微生物群落的组成与互作提供了强有力的工具（Boughner and Singh, 2016；Weiss et al., 2016）。随着网络理论被引入微生物群落互作研究，包括稀疏相关组合数据分析（Sparse Correlations for Compositional data）、分子生态网络分析（Molecular Ecological Network Analysis）、局部相似性分析（Local Similarity Analysis）和共现网络推断（Co-occurrence Network inference）在内的多种算法被相继提出，为利用数学原理从测序数据集中推断微生物互作提供了理论框架（Matchado et al., 2021；Weiss et al., 2016）。值得注意的是，当前微生物网络构建主要依赖扩增子相对定量数据集，忽视了不同样本间总微生物生物量和转录水平的差异。越来越多的证据表明，使用“绝对丰度”构建微生物网络比相对定量能提供更具生态学意义的见解，可纠正相对丰度数据衍生的偏差（Maghini et al., 2023）。例如，基于宏基因组学的MENs表现出显著高于扩增子网络的复杂性，这主要是因为宏基因组学实现了覆盖真菌、细菌和古菌的全面注释，能更好地反映物种在微生物群落中的角色。相比之下，扩增子测序（ITS、16S、18S）通常仅注释单一域（真菌、细菌或古菌），且仅捕获物种的相对丰度。尽管多域网络算法已逐步发展，但它们仍主要反映域间类群的相关性，而非全貌。合并来自扩增子测序的多域类群丰度进行网络构建，可能会在理解物种互作时引入偏差（Feng et al., 2019；Quince et al., 2017）。由真菌、细菌、古菌乃至藻类组成的根际和叶际微生物群落，彼此间存在着互利、捕食和寄生关系，构建涵盖所有这些类群的MENs对于理解微生物群落动态至关重要（Rainey and Quistad, 2020）。为克服扩增子测序在多域定量方面的局限性，研究人员提出使用外源内标来测量根际生态系统中细菌、古菌和真菌的绝对丰度，该方法能够实现更准确的微生物互作分析和网络构建（Faust, 2021）。然而，仍需大量研究来阐明不同测序深度及相应算法如何影响群落结构组成、种间互作和网络架构。揭示叶际和根际等微环境中真实的微生物分子生态网络及其对寄主的影响，对于阐明微生物进化与寄主协同进化至关重要。然而，针对这一热点的研究仍显不足（Yu et al., 2022）。
Cinnamomum migao H. W. Li（樟科）是中国特有物种，仅分布于滇黔桂三省交界地区的干热河谷，其果实已被中国西南少数民族用于治疗心血管疾病（Li et al., 2007）。由于极度稀有和栖息地破坏，C. migao 已被列为IUCN《濒危物种红色名录》中的易危（VU）物种（de Kok, 2024）。研究人员此前的研究表明，C. migao 果实品质与根际微生物互作网络中的关键物种密切相关，根际表现出强大的微生物招募和选择能力（Chen et al., 2023a；Sun et al., 2024）。然而，对果实附生微生物网络的全面理解仍然有限。附生微生物群的组装依赖于寄主植物与微生物之间复杂的通讯和信号网络。阐明根际和叶际微生物与寄主植物之间真实的互作网络和驱动机制具有重要的科学意义，尽管测序方法对理解这些过程有决定性影响（Tkacz et al., 2018）。因此，本研究整合了多种方法：相对定量扩增子测序、绝对定量扩增子测序、2bRAD-M和宏基因组测序，构建根际和叶际群落的微生物数据集。采用非靶向代谢组学分析挥发性代谢物，研究不同测序方法下不同区室中的物种多样性、网络参数、关键物种以及挥发性代谢物与微生物招募之间的关系（Sch?fer et al., 2023）。
研究结果表明，植物根际和叶际形成了不同的生态位，承载着显著分化的微生物群落和不同的多样性。叶际与根际之间绝对扩增子测序与扩增子测序的差异显著影响了由这些群落构建的MENs的性质以及关键物种的鉴定，进一步凸显了在微生物研究中实施绝对定量的重要性。此外，与测序分辨率相关的方法学因素——包括微生物群落边界界定和注释深度——共同影响了叶际和根际微生物系统中网络特征和关键物种的鉴定。值得注意的是，C. migao 根际和叶际的挥发性代谢物被发现与微生物群落系统存在潜在相关性，尽管本研究无法建立因果关系。
论文解读
一、研究背景与科学问题
植物与其附生微生物之间存在着密切而复杂的共生关系，健康的微生物-寄主互作对促进植物生长发育、提高生产力以及抵御病原微生物侵害具有关键作用。在长期协同进化过程中，植物与微生物形成了紧密互联的共生整体，其中根际（rhizosphere）和叶际（phyllosphere）微生物群落分别代表了植物地下和地上微生态系统，是研究植物-微生物互作最具代表性的两个区室。这些微生物群落与其寄主之间形成的稳定微生物生态网络（Microbial Ecological Networks, MENs），深刻影响着微生物群落动态和寄主生产力。
然而，学术界对根际-叶际微生物MENs的认知仍存在重大空白，这些复杂微生物群落的生态过程常被称为科学认知中的“暗物质”。当前微生物网络构建主要依赖扩增子测序的相对定量数据，存在三个核心局限：其一，相对定量忽视了不同样本间总微生物生物量和转录水平的差异，可能引入系统性偏差；其二，扩增子测序（如ITS、16S、18S）通常仅能注释单一微生物域（真菌、细菌或古菌），无法全面覆盖真菌、细菌、古菌乃至藻类等多域类群的互作关系；其三，不同测序方法在注释分辨率、定量方式和群落边界界定上的差异，可能深刻影响网络结构参数和关键物种（keystone taxa）的鉴定结果。尽管已有研究开始关注绝对定量和宏基因组学在微生物网络构建中的应用价值，但不同测序深度和算法如何影响群落结构组成、种间互作和网络架构，仍缺乏系统性的比较研究。
Cinnamomum migao H. W. Li（樟科）是中国西南地区特有的珍稀药用植物，仅分布于滇黔桂三省交界地区的干热河谷，其果实被少数民族用于治疗心血管疾病，已被IUCN列为易危（VU）物种。研究人员此前发现该植物果实品质与根际微生物互作网络中的关键物种密切相关，但对其叶际附生微生物网络以及根际-叶际微生物网络的系统比较仍十分有限。基于此，本研究整合相对定量扩增子测序、绝对定量扩增子测序、2bRAD-M和宏基因组测序四种方法，结合非靶向代谢组学分析，系统探究不同测序方法对C. migao根际与叶际微生物群落认知、MENs构建及关键物种鉴定的影响，以期为植物微生物生态学研究提供方法学参考。
二、主要技术方法
研究人员在贵州省平塘县五年生C. migao人工林中进行采样，选取10株生长均匀的健康植株，分别采集根际土壤和叶际微生物样本，各设10个生物学重复。研究采用了四种高通量测序方法：相对定量扩增子测序（针对细菌16S rRNA基因V3-V4区和真菌ITS1区）、绝对定量扩增子测序（通过添加多浓度外源内标实现绝对丰度计算）、2bRAD-M测序（基于IIB型限制性内切酶简化基因组测序，可注释细菌、古菌和真菌）以及宏基因组测序（基于Illumina NovaSeq平台，可全面注释多域微生物）。同时，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）技术对根和叶的挥发性代谢物进行非靶向代谢组学分析。生物信息学分析包括DADA2降噪、宏基因组组装与基因预测、基于Spearman相关的共现网络构建（使用ggClusterNet包）、Zi-Pi拓扑角色分析鉴定关键物种、中性群落模型（NCM）评估群落组装过程，以及随机森林（Random Forest）回归预测与微生物群落显著关联的代谢物。
三、研究结果
3.1 四种测序方法揭示C. migao根际与叶际微生物群落差异**
扩增子测序和绝对扩增子测序中，根际细菌共注释到43个门（优势类群：酸杆菌门Acidobacteriota、变形菌门Proteobacteria、绿弯菌门Chloroflexi、放线菌门Actinobacteriota），叶际细菌注释到27个门（优势类群：蓝藻门Cyanobacteria、变形菌门Proteobacteria、拟杆菌门Bacteroidota）；根际真菌注释到16个门（优势类群：子囊菌门Ascomycota、担子菌门Basidiomycota），叶际真菌注释到7个门。2bRAD-M测序中根际注释到60个门，叶际注释到39个门。宏基因组测序在根际注释到252个门，叶际注释到235个门。四种方法在根际识别出124个共有属，叶际识别出125个共有属，表明扩大测序范围显著增加了鉴定的类群数量但减少了共有类群。α多样性分析显示根际微生物多样性高于叶际，PCoA分析显示根际和叶际微生物群落组成存在显著差异并形成两个明显聚类，证实两个植物区室形成了截然不同的微生物生态位。
3.2 C. migao根和叶挥发性代谢物差异
GC-MS分析从C. migao根和叶中共鉴定出134种挥发性代谢物，包括48种共有代谢物、51种根特异性代谢物和35种叶特异性代谢物。PCoA分析显示根和叶在代谢物组成和含量上存在显著差异，解释度高达98%。显著差异的代谢通路主要涉及萜类和类固醇生物合成、单萜生物合成以及α-亚麻酸代谢。包括2-乙基呋喃在内的33种成分表现出极显著差异，表明根和叶具有不同的化学生态位，可能与差异化的微生物招募相关。
3.3 四种测序方法下根际和叶际微生物MENs及关键物种鉴定的差异
研究人员基于ASV水平构建了四种测序方法注释的根际和叶际微生物MENs。绝对扩增子测序不仅影响微生物丰度估计，还影响网络节点数和边数，进而改变网络参数如连接度和度中心性。2bRAD-M和宏基因组测序注释了更多微生物类群，导致网络节点和边数逐渐增加，其中宏基因组测序构建的网络最为庞大。随着测序深度增加，网络复杂性逐步提高。基于Zi-Pi分析，随着注释范围扩大，根际和叶际MENs中关键物种数量逐渐增加，但叶际在绝对定量条件下未鉴定出关键物种。根际因微生物多样性更高而检测到更多关键物种。在微生物-环境MENs中，关键物种数量减少，叶际仅在宏基因组测序中检测到关键物种。酸杆菌门（Acidobacteriota）是根际共有的关键物种，子囊菌门和担子菌门在叶际各测序方法中均被注释。引入代谢组数据后，许多先前未被识别的类群被新鉴定为关键物种，同时部分原有关键物种在微生物-代谢物MENs中保持了重要性。
3.4 四种测序方法下挥发性代谢物与关键物种的关系及其对微生物群落的影响
微生物-代谢物MENs在不同测序方法间共享关键代谢物，表明这些代谢物在微生物招募和群落组装中发挥重要作用。根际代谢功能主要富集于萜类相关通路（如单萜生物合成）和脂肪酸代谢（如C5-支链二元酸代谢），以及微生物招募相关通路如原核生物碳固定途径、蛋白质消化吸收和硫代谢。叶际代谢通路同样富集于萜类/类固醇生物合成、脂肪酸代谢及微生物招募相关通路。代谢物-通路关联MENs显示，根际中十七烷、9,12-十八碳二烯酸甲酯和柠檬烯降解与微生物活动关联最强，叶际中(E)-1-(2,6,6-三甲基-1,3-环己二烯-1-基)-2-丁烯-1-酮和十七烷与微生物过程相关性最显著。随机森林模型预测的高贡献代谢物与微生物-代谢物MENs中鉴定的关键物种存在大量重叠。中性群落模型（NCM）分析表明，扩增子测序和绝对扩增子测序数据揭示微生物群落主要由确定性过程主导，但随着注释域扩展（2bRAD-M和宏基因组），随机过程对群落组装的影响逐渐增强。
四、讨论与结论
讨论部分指出，不同测序方法在注释分辨率、定量方式和群落边界界定上的差异深刻影响了微生物群落的认知和MENs的构建。宏基因组测序可注释5至10倍于扩增子测序的微生物类群，但存在寄主基因污染问题；2bRAD-M虽可实现物种水平注释，但产生大量未分类类群；扩增子测序则受限于引物偏好和单一域注释。绝对定量与相对定量在影响网络参数和关键物种鉴定方面存在显著差异，多域网络的构建对于全面捕捉种间互作至关重要。根际和叶际的挥发性代谢物差异可能与微生物招募和群落组装相关，关键物种（主要属于子囊菌门和担子菌门）在维持群落稳定性和多样性方面发挥重要作用，但所有关键物种均基于网络拓扑属性鉴定，属于候选关键物种，其真实生态功能有待实验验证。
研究结论表明，不同植物器官提供了独特的生态位，导致叶际和根际微生物群落组成高度分化并影响网络结构。注释范围和定量方法显著影响两个生态位中微生物MENs的构建和关键物种的鉴定。根际和叶际的挥发性代谢物与微生物群落组装和招募存在潜在关联，但需进一步验证。这些发现强调了测序方法学（注释范围、定量方式）对于界定根际-叶际微生物MENs、定义群落边界和识别关键物种的重要性，提示需要更严格的高通量测序方法研究微生物群落内的种间关系，并需进一步深入验证关键物种的生态功能以确保可靠性。
