《Cellular Signalling》：CYTIP promotes pro-inflammatory activation of microglia through interaction with LRRFIP2 following ischemic stroke
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摘要小胶质细胞介导的神经炎症是大脑缺血/再灌注（I/R）损伤的关键因素。然而，小胶质细胞的功能异质性为定义治疗靶点带来了重大挑战。通过将小鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型的单核RNA测序（snRNA-seq）与经氧糖剥夺/复氧（OGD/R）处理的BV2小胶质细胞的
摘要
小胶质细胞介导的神经炎症是大脑缺血/再灌注（I/R）损伤的关键因素。然而，小胶质细胞的功能异质性为定义治疗靶点带来了重大挑战。通过将小鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型的单核RNA测序（snRNA-seq）与经氧糖剥夺/复氧（OGD/R）处理的BV2小胶质细胞的全转录组RNA测序相结合，我们发现 Cytip 是I/R损伤后一种瞬时"预激"小胶质细胞亚群中高表达的核心调节因子。功能验证表明，Cytip 促进促炎小胶质细胞表型并加重氧化应激，而其敲低可改善这些OGD/R诱导的功能异常。在机制层面，免疫沉淀-质谱分析揭示CYTIP直接与LRRFIP2相互作用。LRRFIP2的过表达可对抗CYTIP介导的致病效应，显著抑制小胶质细胞炎症和IL-1β的产生。这些发现表明，CYTIP通过NLRP3/LRRFIP2轴促进小胶质细胞的炎症反应，提示CYTIP-LRRFIP2相互作用是卒中后恢复的一个有前景的治疗靶点。
引言
缺血性卒中仍然是全球致残和致死的主要原因之一[1]。流行病学预测显示，由于人口老龄化和现代生活方式的改变，其患病率和发病率预计将持续上升[2]。尽管包括血管内取栓和静脉溶栓在内的急性再灌注治疗在临床管理上取得了重大进展[3]，但I/R损伤仍然是实现最佳康复的重大障碍[4]、[5]、[6]。I/R损伤引发自我 perpetuating的病理级联反应，将组织损伤扩展至初始缺血事件之外，加剧梗死扩展并加重神经功能缺损[7]、[8]。因此，迫切需要既能够恢复脑灌注、又能对抗再灌注损伤引发的继发性有害病理反应的治疗策略[9]、[10]。
小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）的常驻先天免疫细胞，是大脑稳态和卒中后炎症反应的关键调节者[11]、[12]。在大脑I/R过程中，小胶质细胞表现出高度动态且依赖情境的功能多样性[13]、[14]。一方面，过度且持久的小胶质细胞激活通过释放活性氧（ROS）、蛋白酶和促炎细胞因子来加剧神经毒性，这些因素共同破坏血脑屏障并促进神经元凋亡[15]、[16]。另一方面，小胶质细胞也协调神经保护过程，包括清除碎片、解决炎症和突触重塑[17]、[18]。
多项研究已汇聚于识别由不同功能标记物定义的小胶质细胞亚群。例如，卒中相关小胶质细胞（SAM）代表I/R损伤后特异性激活的一种瞬时小胶质细胞亚集。SAM功能依赖于PRDX1介导的抗氧化活性，该活性上调骨桥蛋白和铁蛋白等神经保护分子的表达[19]。表达胆固醇25-羟化酶（CH25H+）的小胶质细胞已被鉴定为SAM的一种神经保护亚群，其特征是吞噬能力增强。相反，表达寡聚腺苷酸合成酶样蛋白（OASL+）的小胶质细胞在缺血性脑中积聚，促进神经炎症，且在老年小鼠中更为普遍[20]。此外，研究还鉴定出表现出巨噬细胞样特征和干扰素反应特征的亚群；前者被认为代表了长期寻找的、以CD45表达升高为标志的卒中诱导小胶质细胞亚集[21]。然而，大脑I/R损伤过程中小胶质细胞反应的时间空间动态性仍然知之甚少。
这些多样的表型位于从损伤响应到修复相关状态的谱系范围内[22]。损伤响应极化通常由病原体相关分子模式（如脂多糖）和促炎细胞因子如干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导[23]、[24]，通过多种信号级联发挥作用，包括TLR/NF-κB、JAK/STAT1、MAPK和NLRP3炎症小体信号通路[10]、[25]、[26]。相反，修复相关极化包括多种亚型（如M2a、M2b、M2c），由不同的刺激驱动，共同促进组织修复、免疫调节和炎症解决[27]、[28]。这些抗炎反应通过IL-4/STAT6和IL-10/SMAD通路以及PPARγ/LXR轴介导[7]、[29]。尽管有这一概念框架，但I/R损伤后调控小胶质细胞亚型转换的精确分子开关仍未完全阐明。
在本研究中，我们试图阐明大脑I/R损伤急性期小胶质细胞全面的纵向单细胞转录组图谱。我们鉴定出一种高度特异性的瞬时"预激"小胶质细胞亚群，该亚群在再灌注后24小时达到峰值，作为从稳态到过度炎症状态的关键桥梁。通过整合体内图谱与体外功能筛选，我们鉴定出 Cytip（胞质体素相互作用蛋白）是该预激亚群中显著上调的核心基因。我们的结果表明，CYTIP的表达在再灌注后24小时达到峰值，且其敲低可显著减轻I/R诱导的神经炎症。在机制层面，我们进一步揭示CYTIP通过NLRP3/LRRFIP2信号轴促进炎症反应，揭示了CYTIP在缺血性卒中和神经炎症中此前未被表征的致病作用。
章节摘要
动物与细胞系
动物研究按照《实验动物管理与使用指南》进行，并经华中农业大学机构动物管理与使用委员会批准（批准号：HZAUMO-2021-0011）。使用成年雄性C57BL/6小鼠（7-8周龄，22-24克）。
BV2细胞购自普诺赛（武汉，中国），培养于含1%青霉素-链霉素（百舒，BL505A，合肥，中国）和10%胎牛血清的DMEM培养基（普诺赛，武汉，中国）中
单核转录组分析揭示卒中后小胶质细胞异质性
为系统表征缺血性卒中后动态分子谱和神经免疫细胞异质性，我们构建了小鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）手术和假手术处理后多个时间点（M0h、M3h、M6h、M12h、M24h、M7d和M14d）同侧大脑皮层的高分辨率单细胞转录组图谱。
单核RNA测序（snRNA-seq）数据的无偏聚类，通过UMAP（统一
讨论
在本研究中，我们构建了一个全面的单细胞转录组图谱，刻画了大脑I/R损伤从超急性期到慢性期的七个时间点的小胶质细胞动态变化。这一高分辨率转录组图谱揭示了传统M1/M2二分法之外此前未被认知的小胶质细胞异质性。通过整合体内和体外模型的分析，我们鉴定出CYTIP作为调控小胶质细胞
CRediT作者贡献声明
杨志浩：写作–审阅与编辑，写作–原稿撰写，项目管理，正式分析，数据整理。王一奇：项目管理，方法论，正式分析，数据整理。周云能：项目管理，方法论，正式分析，数据整理。张若霖：方法论。刘畅：方法论。鲍文岱：监督，方法论。秦俊：项目管理。周沛阳：项目管理。李光强：方法论。段超：数据整理。
伦理声明
本研究按照以下动物福利和/或报告指南进行：《实验动物管理与使用指南：第八版》。（华盛顿特区：国家科学院出版社）。本研究经华中农业大学批准。（批准号：HZAUMO-2021-0011）。
资助
感谢中国国家基因库为本项目提供测序服务。本研究受国家自然科学基金资助（批准号：32571174、32400815）以及湖北省自然科学基金资助（2025AFD036、2025AFB569）。
利益冲突声明
作者声明不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。
致谢
作者感谢华中农业大学农业微生物学国家重点实验室提供的荧光交叉相关光谱系统支持，以及华中农业大学生物医学与健康学院提供的共聚焦成像系统。
杨志浩|王一奇|周云能|张若霖|刘畅|鲍文岱|秦俊|周沛阳|李光强|段超|董家文|王海鹏|张敏|杨鑫|水可|董志强
华中农业大学生物医学与健康学院，生命科学技术学院，武汉430070，中国
