《Bioresource Technology》：Opal glass method, an extraction-free way to access microalgae pigment content
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乳白玻璃法（Opal glass method）是一种免萃取（extraction-free）获取微藻色素含量的技术途径。源自20世纪50年代的乳白玻璃技术经稳健化改进后，可用于获取色素光谱的替代指标（proxies of pigment spectra）。本
乳白玻璃法（Opal glass method）是一种免萃取（extraction-free）获取微藻色素含量的技术途径。源自20世纪50年代的乳白玻璃技术经稳健化改进后，可用于获取色素光谱的替代指标（proxies of pigment spectra）。本研究构建了一个包含乳白玻璃光谱与甲醇萃取（methanol-extraction）光谱的数据库，并采用偏最小二乘回归（Partial Least Squares, PLS）与卷积神经网络（Convolutional Neural Network, CNN）建立乳白玻璃光谱与微藻色素含量之间的关联模型。两种方法均取得了令人满意的预测效果：PLS的平均绝对百分比误差（Mean Absolute Percentage Error, MAPE）为10–15%，CNN的MAPE低于10%。此外，训练上述方法所需的样本量较少，PLS仅需60–90个样本，CNN仅需80–150个样本，表明该方法在实际实验室部署中具有较高的可行性与推广潜力。
论文解读：基于乳白玻璃法的免萃取微藻色素含量检测技术
一、研究背景与问题
微藻细胞色素含量在培养过程监测中具有重要作用。一方面，色素含量可反映细胞生理状态，尤其是与细胞氮素状态密切相关——氮缺乏会通过再分配机制导致叶绿素减少，而氮补充则可恢复叶绿素生物合成并诱导细胞复绿。另一方面，色素组成直接决定生物质商业价值，色素含量越高通常意味着更高的市场价值，这一经济价值在类胡萝卜素（carotenoids）领域尤为突出，其中叶黄素（lutein）因其健康益处而备受关注。
然而，目前尚无一种检测方法能够同时满足快速、可靠、廉价三大要求。现有主流方法主要分为两类：分光光度法（spectrophotometric methods）和高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）。分光光度法虽高效、低成本且操作简便，但存在三点局限：其一，传统方法无法区分单个类胡萝卜素种类，只能报告为叶黄素类与胡萝卜素类之和；其二，样品通常需经洗涤和冷冻干燥处理，这一步骤耗时至少8小时，无法实现培养系统取样后的即时反馈；其三，色素提取涉及潜在有毒化学品（如甲醇）。HPLC法虽被视为参考方法，可对化合物进行色谱柱分离后逐一定量，但其分析时间更长、设备昂贵且需专业人员设计操作流程，同样涉及有毒化学品的使用。
微藻培养物颜色直观可见，但直接测量色素含量却面临物理与生物层面的双重挑战：微藻培养物是微小颗粒的悬浮体系，其粒径使其与光发生复杂相互作用，因此直接色素测量受细胞尺寸、细胞与介质折射率之比、细胞光散射模式（phase function）、测量设备内部几何结构以及色素的生物排列方式等多因素影响。为克服散射干扰，已有研究者提出多种方案，包括使用积分球（integrating sphere）捕获散射光、利用牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）限制折射率比值，以及Shibata等人于20世纪50年代提出的乳白玻璃法——通过在分光光度计光束中放置光学漫射器（如滴油纸），使系统内部散射增强至微藻散射可忽略的程度，从而消除散射引起的谱线基线畸变。尽管该方法简便易用，但文献中提及甚少，且已有改进方案（如双室比色皿）存在操作繁琐、设备易老化等局限。
基于上述背景，本研究旨在整合现有技术要素，开发一种易用、免萃取、非破坏性、可现场实施的微藻色素测量技术。
二、研究内容与结论
研究人员采用Shibata乳白玻璃技术获取微藻样品的乳白玻璃光谱，并证明所得光谱可与色素萃取后分光光度法定量结果建立合理置信水平（±10%）的关联。数据处理采用线性与非线性两种机器学习方法：偏最小二乘回归（Partial Least Squares, PLS）计算速度极快，而卷积神经网络（Convolutional Neural Network, CNN）计算资源需求较高但可实现更高性能。此外，研究进行了学习曲线分析，以告知读者训练该技术所需样本数量，评估其在实验室部署的合理性。
三、关键技术方法
本研究的数据产生于营养转换（trophic conversion）实验，该实验条件下细胞从异养低色素表型向光养高色素表型转变，表型可塑性显著，特别适合构建数据点间对比度最大的数据库。研究使用两种微藻：普通小球藻（Chlorella vulgaris 211-11b，购自德国SAG培养物保藏中心）和索罗金小球藻（Chlorella sorokiniana，由法国Biorea公司惠赠），均在Bold基础培养基（Bold's Basal Medium, B3N）中培养。普通小球藻实验在摇瓶中进行，索罗金小球藻实验在平板光生物反应器中进行。样本在营养转换过程中不同时间点采集，一份用于色素萃取与谱分析，另一份用于即时乳白玻璃分析。色素定量采用甲醇萃取结合分光光度法，依据Wellburn高分辨率方程和Lichtenthaler处理指南计算叶绿素a、叶绿素b及总类胡萝卜素含量。主要技术方法包括：乳白玻璃光谱采集技术、甲醇萃取分光光度定量法、偏最小二乘回归模型、卷积神经网络模型以及学习曲线分析方法。
四、研究结果
乳白玻璃光谱与萃取光谱数据库的构建。 研究人员在营养转换实验过程中同步采集乳白玻璃光谱和甲醇萃取光谱，建立了涵盖两种微藻在不同培养条件下的大规模光谱数据库，为后续模型训练提供了数据基础。
PLS与CNN模型的预测性能。 研究采用偏最小二乘回归和卷积神经网络两种方法建立乳白玻璃光谱与微藻色素含量之间的关联模型。结果显示两种方法均取得满意效果：PLS的平均绝对百分比误差（Mean Absolute Percentage Error, MAPE）为10–15%，CNN的MAPE低于10%，表明乳白玻璃光谱能够以较高精度预测微藻色素含量。
训练样本量需求分析。 学习曲线分析表明，训练上述方法所需样本量较少：PLS仅需60–90个样本，CNN仅需80–150个样本。这一结果说明该技术在实际实验室部署中具有较高的可行性和较低的数据采集门槛。
五、讨论与结论
本研究通过整合Shibata乳白玻璃技术与机器学习方法，成功开发出一种易用、免萃取、非破坏性、可现场实施的微藻色素测量技术。该方法以系统内部散射增强的方式消除微藻细胞散射对光谱的干扰，所得光谱与色素萃取定量结果可建立±10%置信水平的关联。线性方法PLS计算极快、所需样本量少，适合快速部署；非线性方法CNN预测精度更高，适合追求更高性能的应用场景。研究结论表明，乳白玻璃法结合机器学习可作为一种实用的微藻色素含量快速检测方案，在保证合理精度的同时显著简化操作流程、缩短检测时间并减少有毒化学品的使用，为微藻培养监测和色素生产提供了一种新的技术路径。
