引言
Haematococcus pluvialis是虾青素最有效的天然来源，其干重中虾青素的含量可超过4%（Shah等人，2016年）。H. pluvialis的大规模培养遵循两个阶段的生活周期：首先是绿色运动细胞阶段，用于细胞密度的积累；随后在高光照、营养缺乏和盐分压力等环境压力下进入红色无鞭毛孢子阶段，以产生虾青素（Cui等人，2025年）。当受到压力时，易感的绿色运动细胞会转化为无鞭毛孢子，并失去快速分裂的能力（Han等人，2012年）。然而，虾青素和三酰甘油（虾青素的主要储存形式）主要是在压力条件下产生的，因为它们的合成基因受压力调控（Cui等人，2025年；Lemoine和Schoefs，2010年；Shah等人，2016年）。事实上，即使在关键合成基因过表达的情况下，绿色细胞在无压力条件下也无法显著积累虾青素（Galarza等人，2018年；Sproles等人，2021年）。因此，生长与压力诱导的虾青素生产之间的矛盾成为简化传统培养方法的主要瓶颈（Mota等人，2022年）。
大量研究表明，乙酸盐在H. pluvialis的培养中具有双重功能：在异养或混合营养条件下，它能促进生物量的积累并诱导虾青素的产生（He等人，2018年；Wang等人，2021年；Yu等人，2022年）。然而，乙酸盐的添加总是伴随着负面影响，包括抑制细胞分裂和加剧压力引起的细胞损伤（He等人，2020年；Joun等人，2023年；Li等人，2026年；Zhang等人，2019年）。在低浓度（约0.5–1.5 g/L）下，乙酸盐可以增加混合营养状态下的生物量，同时抑制光自养活动（Joun等人，2023年；Zhang等人，2019年）；而在高浓度（约2–10 g/L）下，它会抑制绿色细胞的增殖并加速无鞭毛孢子的劣化，这两者都会降低最终虾青素的产量（He等人，2020年；Kobayashi等人，1991年）。与能耐受高达10 g/L NaAc浓度的Chlorella vulgaris相比（Peng等人，2024年），H. pluvialis的绿色运动细胞对乙酸盐的耐受性明显较低。这种固有的敏感性，加上乙酸盐的有效作用，使得提高其对乙酸盐的耐受性成为一个具有战略意义的目标。
适应性实验室进化（Adaptive Laboratory Evolution, ALE）是一种强大的、非针对性的微生物表型工程策略（Sandberg等人，2019年）。ALE能够在长期选择压力下促进微生物群体中有益突变的自发积累，从而增强其对有毒化合物的耐受性等适应性特征（Mavrommati等人，2022年）。这种方法已成功应用于细菌、酵母和微藻（Dragosits和Mattanovich，2013年；Shiu等人，2014年；Zhao和Huang，2021年）。例如，在Chlorella中，ALE提高了脂质的生产率和高价值脂肪酸的积累（Varunraj等人，2023年；Zhang等人，2025年）；在Scenedesmus中，ALE增强了其对烟气的耐受性（Cheng等人，2019年）。
将ALE应用于H. pluvialis可以提升其对乙酸盐的耐受性，并缓解生长与虾青素生产之间的矛盾。然而，目前尚未有关于在H. pluvialis中系统应用ALE的报道。在这里，我们采用了一种定向的多轮ALE方法，培育出了对乙酸盐耐受性逐渐提高的H. pluvialis菌株。从野生型（WT）开始，我们获得了适应2.5 g/L（AC25）、5 g/L（AC50）和7.5 g/L（AC75） NaAc浓度的菌株。随后对这些进化菌株与野生型进行了全面的生理和转录组分析。研究结果表明，乙酸盐压力下的ALE同时增强了H. pluvialis的乙酸盐耐受性、生物量积累和虾青素产量，为简化虾青素的生产提供了改进的菌株和机制上的见解。
章节片段
藻类菌株及培养条件
野生型（WT）菌株H. pluvialis 797来自中国科学院水生生物学研究所。通过渐进式增加乙酸盐压力的适应性实验室进化（ALE），我们相继获得了三个进化菌株——AC25、AC50和AC75。所有培养都在23±1°C的无菌条件下进行。绿色生长阶段使用改良的BG-11培养基，并在1500±300 lx的光照强度下进行。
适应过程中的生长动态（图1a–c）遵循了微生物进化的经典“选择-富集-稳定”路径（Carpenter等人，2023年）。通过生存分析（图1d）定量验证了所获得的耐受性。AC50菌株在5 g/L NaAc压力下的存活率为81%，比野生型提高了422%；AC75菌株在7.5 g/L NaAc压力下的存活率为44%，比相应的野生型提高了460%；而AC25菌株没有显著差异
通过渐进式的乙酸盐适应培养（progressive acetate-based ALE），我们获得了对乙酸盐耐受性显著提高的H. pluvialis菌株，其生长和虾青素产量也得到了改善。在5 g/L NaAc压力下选出的AC50菌株，在绿色生长阶段的生物量和虾青素产量分别比野生型提高了54%和80%，同时在红色生长阶段保持了高产量。转录组分析显示，该菌株经历了多层次的代谢重编程：相关基因得到了靶向上调
