循环水养殖系统（RAS）中表观健康大西洋鲑（Salmo salar）鳃组织形态学与免疫相关基因表达的探索性并发分析：跨淡水与海水生产阶段

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Concurrent analysis of histomorphology and immune-related gene expression in gills of Atlantic salmon ( Salmo salar) from recirculating aquaculture systems

鳃健康在水产养殖中至关重要，但由于鳃是对环境和生物胁迫具有非特异性反应的动态器官，其仍难以定义。这项描述性、探索性研究检查了来自两个商业循环水养殖系统（recirculating aquaculture systems, RAS）的选定表观健康大西洋鲑（Salmo salar）的组织学变化和基因表达模式，涵盖淡水与海水生产阶段。这两个系统在设施、鱼体大小和生活阶段方面也不同。研究人员使用半定量组织学评分系统和实时定量逆转录PCR（RT-qPCR），评估了轻度鳃改变——包括黏液细胞数量增加、鳃小片棒状化（lamellar clubbing）和炎症——与选定免疫和生理标志物表达之间的关联。所选材料包括具有和不具有明显形态变化的鱼，从而允许在纳入范围内探索性检查基因-形态关系，但不能估计鳃改变的群体患病率。在该材料中，来自海水生产系统的鱼的黏液细胞、鳃小片棒状化和鳃小片炎症评分较高。经多重检验校正后仍显著的关联包括鳃小片棒状化与干扰素-α（IFN-α）和免疫球蛋白T（IgT）、鳃小片炎症与IgT、黏液细胞数量与免疫球蛋白M（IgM）、以及黏液细胞数量与Na⁺,K⁺–ATPase α-1a（NKA α-1a）。Ca. Branchiomonas cysticola 是唯一检测到的病原体，并在亚临床载量下与鳃小片炎症增加相吻合。这些探索性发现描述了所选样本内的形态学和转录变异，并证明在评估RAS养殖鲑的鳃健康时，结合组织学、基因表达和病原体检测的价值。

论文解读

作者为 Thomas Amlie、Simen Foyn N?rsteb?、Rakesh Das、Cheng Xu、?ystein Evensen，来自 DNV Aquaculture and Ocean Health, Sistranda, Norway。鳃健康是鱼类整体福祉的基础，但健康鳃的定义仍不明确，并因所用指标、生物功能、结构完整性、鱼行为或生产力而异。鳃结构偏离所谓正常并不必然意味着健康受损。了解表观健康鱼鳃形态的典型变异，有助于判断观察到的鳃改变与整体健康的相关性，也可阐明从正常变异到临床疾病阶段的进展。在水产养殖中，亚临床阶段检测鳃健康负向趋势很关键，可及时干预并防止集约化养殖下死亡。鳃病可有感染性或非感染性来源，但常被描述为多因素。评估鳃健康的方法包括宏观评分、显微组织学评分及分子方法检测病原和关联基因表达与组织病理。分子变化可影响鳃功能并可能先于形态变化。许多研究探讨外部因素和传染因子对鳃基因表达的影响。评估表观健康鱼鳃基因表达变异是否在形态水平反映，可提供早期或轻度组织反应线索；表征共现的形态和分子模式有助于识别值得进一步调查的变化。但估计流行率或建立群体参考范围需要代表性采样。因此，研究人员在两个商业RAS生产系统、涵盖淡水和海水生产阶段，表征表观健康大西洋鲑鳃形态和选定免疫/生理标志物表达，并用qPCR评估机会病原，同时纳入外部/行为异常鱼比较；设计目的是描述所选材料中形态和基因表达范围、探索基因-形态关联，而非估计流行率或定义群体正常基线。

关键技术方法概括：样本队列来自两个商业RAS设施，设施1淡水养殖至smolt约150 g，设施2海水从smolt至市场规格；包括四个鱼组、表观健康池及54尾偏离鱼，最终111尾进入组织学-RT-qPCR关联分析。第二鳃弓分别以福尔马林固定或RNAlater保存。采用半定量组织学评分评估七项鳃改变；提取RNA后以RT-qPCR检测选定免疫/生理基因和机会病原。统计使用Wilcoxon秩和检验、Kruskal-Wallis检验、广义线性模型（generalized linear models, GLM）、负二项/泊松/线性回归、方差膨胀因子（variance inflation factor, VIF）和假发现率（false-discovery rate, FDR）校正，并采用盲法随机编号。

研究结果

组织学评分：111尾具有组织学和PCR链接数据。在所选表观健康鲑中，两个生产系统和采样时间点均观察到轻度鳃改变。盐水生产系统鱼黏液细胞数量增加和鳃小片棒状化更突出，鳃小片炎症评分也更高；由于盐水系统也在设施、鱼体大小、生命阶段和采样时间上不同，这些差异不能仅归因于水类型。其他组织学参数两系统较相似。盐水系统内FG4鳃小片棒状化评分高于FG3。偏离鱼与表观健康鱼在盐水系统中组织学评分无显著差异，除间鳃小片细胞增多和退行性变化评分倾向更高。

免疫和生理标志物：核密度图和正态分位图显示多个免疫和生理标志物呈双峰，Shapiro-Wilk检验指示违反正态。淡水鱼基因表达一般高于海水鱼（较低ΔCq）。例外为IL-8、IgM和TGF-β，两环境相似。Wilcoxon秩和检验支持该结果；Kruskal-Wallis检验显示各环境内鱼组间差异，IgM除外。环境差异最明显为IFN-α、SAA-5、NKA α-1a和Rhcg1。NKA α-1a在淡水鱼最高，NKA α-1b在海水鱼高于NKA α-1a。各采样时间点，淡水鱼α-1b表达通常高于α-1a，最小鱼除外；α-1b（淡水）和α-1a（海水）可检测且跨鱼体大小表达相对相似。盐水系统表观健康鱼与偏离鱼在IL-1β、IL-8、SAA-5、IgM和NKA α-1a存在差异。

鳃机会病原：Ichthyobodo spp.、Paranucleospora theridion和Saprolegnia spp.检测阴性。Ca. Branchiomonas cysticola在FG2（23尾中9尾阳性，平均Cq 34，范围27-38）和FG4（16尾中15尾阳性，平均Cq 29，范围23-37）检出，FG1和FG3未检出。其载量似随时间增加，并与多数免疫标志物正相关。在盐水中，较高载量与IgT和IgM表达增加及IL-4/13α表达降低相关。较高载量与鳃小片炎症总评分增加吻合，在盐水中最明显。这些关系为关联性，横断面材料不能建立因果作用。

免疫和生理标志物与鳃形态：初步分析检查所选表观健康材料内基因表达与鳃改变关联，重点为黏液细胞增殖、鳃小片棒状化和鳃小片炎症，因为这些是盐水生产系统鱼中最明显改变。

免疫标志物：黏液细胞评分与免疫标志物散点图无明显相关，但多个标志物间相关（共线）。随后多预测因子回归中，纳入许多变量出现多重共线性，导致系数不稳定、标准误膨胀和统计功效降低；VIF常超过阈值。研究人员通过系统测试较小预测因子组，获得可接受VIF模型，并评估成对相关。使用标准线性、泊松和负二项回归，后者用于过离散。

黏液细胞：FDR校正前，Cox-2b、IgM和IL-4/13α与黏液细胞评分呈名义关联；校正后仅IgM关联仍显著。黏液评分随IgM和IL-4/13α水平增加而增加（负值表示Cq下降、表达增加）。Cox-2b总体系数0.22但随Cq范围变化；表达增加时黏液细胞评分下降。模型整体显著，pseudo-R² 0.077，解释力低。

鳃小片棒状化：负二项回归识别IFN-α和IgT为显著预测因子。模型整体显著，pseudo-R² 0.247，解释力较好。IFN-α和IgT表达与鳃小片棒状化正相关，即Cq下降与棒状化评分增加一致。

鳃小片炎症：负二项回归中IgT是唯一显著解释响应变量变异的预测因子。IgT表达较高与鳃小片炎症增加一致。

生理标志物：黏液细胞评分与生理标志物散点图模式类似。NKA α-1a是黏液细胞评分唯一显著预测因子（p=0.002），NKA α-1b和Rhcg1不显著。线性模型整体显著，仅NKA α-1a显著解释黏液细胞评分；VIF<1.5，残差图无异方差（Breusch-Pagan/Cook-Weisberg p=0.83）。NKA α-1a表达与黏液细胞评分正相关。对鳃小片炎症，NKA α-1a表达增加与更高评分相关（p=0.034），无共线性，无异方差（p=0.18）。对鳃小片棒状化，无预测因子p<0.05。FDR校正后，鳃小片棒状化与IFN-α（q<0.001）和IgT（q=0.030）、鳃小片炎症与IgT（q=0.003）、黏液细胞数量与IgM（q=0.004）、黏液细胞数量与NKA α-1a（q=0.007）仍显著。鳃小片炎症与NKA α-1a以及IL-4/13α、Cox-2b、NKA α-1b、Rhcg1相关关联未保留显著，视为名义和探索性。

讨论与结论

所选材料显示两个商业RAS表观健康大西洋鲑轻度形态改变。盐水系统鱼黏液细胞数、鳃小片棒状化和鳃小片炎症评分更高，较大个体尤甚；差异为描述性，因为水环境与设施、鱼体大小、生命阶段和采样时间不可分。基因表达谱在系统和鱼组间不同。多重检验校正后最稳健基因-形态关联涉及IFN-α和IgT与鳃小片棒状化或炎症、IgM与黏液细胞数量、NKA α-1a与黏液细胞数量。Ca. Branchiomonas cysticola亚临床水平检出并与鳃小片炎症增加吻合，但横断面设计不支持因果推断。表观健康鳃不一定无形态改变；所选材料不能确定这些变化在源群体中常见程度或定义群体正常鳃形态。与既往在罗非鱼、虹鳟和大西洋鲑中的研究一致，轻度改变包括上皮肥大/增生、炎症和黏液细胞增殖；棒状化未在此前研究中评估。临床相关性高度依赖程度和解剖位置，尤其层状增厚是否增加血-水扩散距离并损害气体交换。讨论还涉及各标志物：IFN-α在鳃中组成型表达，调节炎症并针对病毒和细菌威胁；RAS鱼对poly I:C的炎症反应强于开放网箱鱼。IgT由黏膜B细胞产生，对包括鳃在内的黏膜免疫重要；细菌感染后B细胞、IgT表达和IgT增加。黏液细胞在健康鱼鳃小片中通常较少，但刺激和疾病可使其增殖。IL-4/13α在鲑鳃组成型高表达，与Th2免疫反应和寄生虫反应相关，可能参与鳃黏液产生。NKA α-1a为淡水主导离子摄取型，α-1b为海水主导离子分泌型；本研究中α-1a在淡水高于海水，α-1b在海水高于α-1a，但两种异构体在两环境均检出且模式偏离预期，未明确异构体切换。Cox-2b在鳃组成型表达，提示免疫准备；其催化花生四烯酸转化为前列腺素，介导炎症。IL-4/13α与黏液细胞数量增加关联突出。病原方面，Ca. Branchiomonas cysticola常见于淡水和海水养殖鲑，包括无明显鳃病理鱼；较高载量曾与增殖性鳃炎症相关，但近期工作未证明细菌载量与上皮增生一致关系。mRNA仅部分反映蛋白丰度，未来需蛋白质组分析。局限包括：水环境与设施、鱼大小、生命阶段和采样时间混杂；材料选择部分基于组织学适宜性和有无鳃改变，非源群体代表，频率和严重度不能作流行率或群体参考；选择可能影响关联幅度和不确定性；仅FDR后显著关联应视为相对稳健，仍需独立前瞻验证。

研究结论翻译：本研究应被解释为探索性，描述了两个商业RAS生产系统中故意选择的表观健康大西洋鲑样本中的轻度鳃改变、选定转录标志物和病原检测。轻度形态变化存在于无显性鳃病的鱼中，但采样设计不能确定这些变化在源群体中有多常见，也不能定义正常群体基线。在所选材料内，来自海水生产系统的鱼黏液细胞、鳃小片棒状化和鳃小片炎症评分较高；然而这些描述性差异不能归因于水类型，因为设施、鱼体大小、生命阶段和采样时间存在混杂。多重检验校正后最稳健的关联涉及IFN-α和IgT与鳃小片棒状化或炎症，以及IgM和NKA α-1a与黏液细胞数量。Ca. Branchiomonas cysticola在亚临床水平被检出并与鳃小片炎症增加吻合，但因果关系未建立。这些发现说明仅从组织病理学或转录数据解释鳃健康的复杂性，并支持形态学、分子和病原数据联合使用。需要代表性前瞻性研究来估计轻度鳃改变的患病率并验证所识别的基因-形态关系。