《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》：Integrated transcriptomic and deep learning analyses define acRG signature for prognosis and therapeutic options in osteosarcoma
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•单细胞特征分析揭示ac4C相关基因活性主要富集于成骨性恶性细胞中。•一种整合机器学习框架定义了稳健的六基因特征（acRGBS），可预测生存率并反映免疫逃逸能力。•S100A13被确定为预后核心基因，可促进骨肉瘤细胞增殖和体内肿瘤生长。•S100A13与MCU发生物理结合，维
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单细胞特征分析揭示ac4C相关基因活性主要富集于成骨性恶性细胞中。
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一种整合机器学习框架定义了稳健的六基因特征（acRGBS），可预测生存率并反映免疫逃逸能力。
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S100A13被确定为预后核心基因，可促进骨肉瘤细胞增殖和体内肿瘤生长。
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S100A13与MCU发生物理结合，维持线粒体钙稳态并防止氧化应激诱导的凋亡。
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S100A13的耗竭触发线粒体钙超载，并显著增强骨肉瘤对顺铂治疗的敏感性。
引言
骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤，也是该年龄段癌症相关死亡的主要原因之一[1], [2]。尽管手术和多种药物联合化疗取得了进展，但近年来长期生存率仅有所改善，尤其是对于转移性或复发性疾病患者而言[3]。有效管理的一个主要障碍是骨肉瘤显著存在瘤内及患者间的异质性，这导致治疗敏感性差异、早期扩散和频繁复发[4], [5]。因此，确定能够反映肿瘤侵袭性并指导风险分层和治疗决策的稳健分子标志物具有重要的临床意义[5]。
与基因组和表观遗传学改变并行的是，转录后调控已成为塑造癌症表型的关键层面[6]。在众多RNA修饰中，N4-乙酰胞苷（ac4C）因其调节RNA稳定性、剪接和翻译的能力而备受关注[7], [8]。越来越多的证据表明，ac4C相关调控的失调促进增殖、侵袭、代谢重编程和治疗耐药等多种恶性行为[9], [10], [11]。然而，ac4C相关基因（acRGs）在骨肉瘤中的功能景观和临床相关性仍有待进一步明确，acRG活性能否转化为临床实用的预后框架也尚不清楚[2], [4], [12]。
要更深入地了解骨肉瘤，还需要解析肿瘤微环境（TME）的细胞组成和空间组织结构[4], [13]。单细胞RNA测序（scRNA-seq）可以区分恶性和非恶性区室，揭示整体转录组分析中隐藏的功能状态[14]；而空间转录组学则能在组织学结构内提供转录程序的原位背景信息[15], [16]。与此同时，免疫治疗在多种癌症中展现出变革性的疗效，但其临床获益在骨肉瘤中有限且异质性较大，这凸显了对反映免疫浸润模式、免疫逃逸潜力和免疫检查点阻断响应可能性的生物标志物的迫切需求[2], [17]。将多组学数据与计算免疫解卷积和免疫逃逸建模相结合，可能有助于揭示导致治疗结局差异的免疫表型[18], [19]。
在本研究中，我们对bulk RNA-seq、scRNA-seq和空间转录组学进行了整合分析，以系统刻画骨肉瘤中acRG活性及其生物学和临床意义。我们首先在单细胞水平绘制acRG活性图谱，以鉴定acRG高和acRG低细胞状态、其细胞间通讯模式及其与肿瘤相关通路的关系。随后，我们利用全面的机器学习框架开发了一种基于acRG的预后特征（acRGBS），并在独立队列中验证了其稳健性。为探索潜在的治疗相关性，我们使用多种互补的计算方法评估了免疫浸润、免疫检查点表达、免疫逃逸特征和免疫治疗响应预测。此外，我们应用Scissor将生存相关的bulk表型与特定的单细胞状态联系起来，并构建了基于注意力的深度神经网络模型以评估acRGBS的预测性能。最后，利用空间转录组学验证了关键特征基因在肿瘤富集区域内的原位分布。
为拓展这些计算发现，我们聚焦核心基因S100A13，探讨其在骨肉瘤进展中的功能意义。我们结合体外实验和体内异种移植模型，评估S100A13对细胞增殖、凋亡和肿瘤生长的影响。机制研究揭示S100A13与线粒体钙单向转运体（MCU）发生物理相互作用。这一相互作用对于维持线粒体钙稳态和防止活性氧诱导的氧化应激至关重要。最后，我们探讨了靶向S100A13/MCU轴能否增强骨肉瘤细胞对顺铂治疗的敏感性。总之，我们的工作从多个维度刻画了骨肉瘤中ac4C相关调控的景观，并提出了一种具有临床相关性的特征，可能有助于预后评估和个体化治疗策略。
各章节片段
公共可获取临床数据分析
基因表达数据集及其对应的临床特征信息（包含两个独立验证队列GSE39055和GSE16091）从基因表达综合数据库（GEO）获取。同时，骨肉瘤患者的RNA-seq数据及匹配的临床信息从癌症基因组图谱（TCGA）获得。单细胞RNA测序数据（GSE152048）和空间转录组学数据集（GSE200310）也从GEO下载。ac4C相关基因列表
单细胞RNA测序图谱表征骨肉瘤
单细胞RNA测序数据集GSE152048包含来自骨肉瘤患者的11个肿瘤样本，进行了全面分析。经过严格的质量过滤后，共保留了82,368个高质量细胞用于后续研究。无监督聚类揭示了多个转录上具有明显差异的细胞群（图1A），随后基于经典标志基因表达进行了注释（图1B）。这些簇包含软骨成骨细胞
讨论
在本研究中，我们整合了bulk转录组学、单细胞分辨率表征、空间转录组学和基于深度学习的建模，全面描绘了骨肉瘤中ac4C相关基因活性的景观[15], [30]。与以往聚焦于单个表观遗传调控因子的研究不同，我们的工作系统地将RNA乙酰化相关的转录程序与肿瘤异质性、免疫重塑和患者预后联系起来[8]。
单细胞分析
结论
总之，本研究通过整合多组学和深度学习方法，从多个维度刻画了骨肉瘤中ac4C相关基因调控的景观。我们鉴定出一种稳健的acRGBS，能在多个独立队列中有效分层患者风险，并反映不同的免疫微环境特征。我们的功能实验进一步确立了S100A13作为肿瘤进展和治疗耐药的关键驱动因子。我们证明S100A13
发表同意声明
所有作者均已阅读并批准了本文的最终版本。他们一致同意提交和发表本研究。
伦理声明
本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究已获得上海市杨浦区医院伦理委员会批准（批准号：LL-2026-DWSY-011）。
资助
本研究未获得公共、商业或非营利部门任何资助机构的专项资助。
洪磊 肖|杨晓龙|周茂斌|常宏泽|张艳|刘晓东|蔡峰
