假体周围关节感染中的下一代测序技术

《Infectious Diseases & Immunity》：Next-Generation Sequencing in Periprosthetic Joint Infections

　　

假体周围关节感染（PJI）是全髋关节置换术和全膝关节置换术后最令人恐惧的并发症之一。早期诊断和最佳治疗对于管理PJI至关重要，而近期可用的基于核酸的诊断方法可能有助于准确检测致病原。下一代测序（NGS）在培养阴性PJI病例以及不典型病原体检测中显示出独特价值。NGS的应用可为PJI治疗中的抗菌药物管理带来重大益处。NGS通过快速精确地鉴定病原体，使PJI患者能够接受更早、更有效的治疗干预。这一技术对于检测罕见的、新型的多微生物感染尤为关键，而这些感染往往是传统诊断方法难以识别的。

随着美国人口老龄化，全关节置换术（TJA）正变得更加普遍。Sloan等人1报道，预计到2030年全髋关节置换术（THA）将增长71%（达到635,000例手术），全膝关节置换术（TKA）预计将增长85%（达到126万例手术），THA平均年龄为65岁，TKA平均年龄为66岁。1?2随着这些手术数量的增加，相关并发症也预计将上升。假体周围关节感染（PJI）可以说是THA和TKA术后最令人恐惧的并发症之一。在Medicare人群中，感染是髋关节和膝关节翻修手术的首要原因。3 PJI的发病率约为0.2%–2%，且在全球范围内呈上升趋势。??? PJI导致死亡率显著增加，并对患者的身心健康产生负面影响。???早期诊断和适当治疗对于管理PJI至关重要，??1?而准确检测致病原可能受益于近期可用的基于核酸的诊断方法。11?1?

目前，PJI的诊断是一个非常具有挑战性的问题。没有单一的确诊测试，因此，遇到疑似PJI病例的临床医生会使用包括微生物学特征、临床表现和患者生物标志物在内的组合测试，例如2018年国际共识会议（ICM）PJI标准。1?诊断严重依赖于培养结果，培养结果是主要诊断标准和次要诊断标准的组成部分；然而，高达45%的培养结果无细菌生长。11?1?由于PJI可能是多微生物感染，分离病原体对于改善患者预后至关重要。1?在一项针对219例患者（138例髋关节和81例膝关节）接受培养阴性PJI治疗手术的研究中，约30%的患者在超过1年的随访中治疗失败。在49例治疗失败的培养阴性PJI中，约50%随后培养呈阳性；在这26例中，有10例（38.5%）对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌呈阳性。1?即使在膝关节的两阶段翻修置换中，培养阴性也预示治疗失败（比值比：4.5；95%置信区间：1.3–15.7）。2?为改善常规细菌培养，各种新的分子技术已被开发出来。

我们的重点是基于下一代测序（NGS）的诊断方法，这些方法通过核酸测序提供潜在的全面病原体检测，并通过与参考数据库比对进行鉴定。NGS具有比培养更高的敏感性和相当的特异性。1??1?

下一代测序的监管环境

尽管微生物NGS被认为是一种有价值的工具，但NGS转化为常规患者护理受到了混乱且不断变化的监管环境以及保险提供者不愿承担此测试费用的复杂性阻碍。只有少数微生物NGS检测获得美国食品药品监督管理局（FDA）的上市批准，而FDA最近提出了一项规则，将基于NGS的实验室开发检测（LDTs）归类为医疗器械。21多个专业组织公开反对这一分类，认为它可能会大幅限制推动LDTs创新的动力，从而损害患者利益。22?2?与此举措相关，今年FDA首次通过突破性设备计划为NGS发出了上市许可，用于呼吸道感染。

相反，大多数LDTs遵循《临床实验室改进修正案》的法规，并由美国病理学家学院认证，后者对LDTs及其实验室提供者的技术有效性、可重复性和数据可访问性提出了各种标准要求。《临床实验室评估计划》进一步对可能接受纽约州标本的诊断实验室提供者进行监管，在验证标准和人员要求方面更加严格，此外还包括现场检查和能力测试。这些机制共同创建了一个分层框架，确保医生和临床微生物学家能够订购经过严格验证并定期评估的NGS LDTs。

一些私人保险支付者不报销NGS LDTs费用的一个引述原因是这些测试被视为实验性的，目前还没有足够的证据支持其使用，2?这促使研究人员和LDTs提供者越来越多地采用临床研究设计，以证明NGS指导的护理在各种医疗场景和患者护理结果方面优于标准护理。2??32考虑到这些近期的发展和NGS整合的障碍，本综述的动机之一是审视目前骨科感染领域可用的NGS LDTs的现状，讨论NGS在临床环境中与在研究中使用的关键区别因素，并重点介绍其应用和成本效益的最新研究。

商业化NGS技术

商业化用于感染性疾病微生物谱分析的基于NGS的方法可分为靶向扩增子测序（例如，16S rRNA测序）和鸟枪法宏基因组测序11?33?3?（表1）。图1展示了一个整合定量聚合酶链反应（qPCR）和NGS技术用于细菌和真菌靶向分析的临床工作流程示例。NGS在常规实践中最早的使用可追溯到2010年，2???2当时是基于靶向16S rRNA和内转录间隔基因扩增子测序——分别是细菌和真菌中保守的通用基因靶标。2???2这种方法的创新之处在于从可能主要由宿主DNA组成的样本中选择性扩增目标微生物DNA。与鸟枪法宏基因组测序相比，这种选择方法使得该检测可以应用于多种类型的样本，而相对较少需要实验室优化和测序深度。

表1 商业化用于感染性疾病且在PJI中使用的微生物NGS方法

| 方法 | 配套诊断 | 接受的样本类型 | 结果驱动的发现* | 提供者 | 参考文献 |
|------|---------|--------------|---------------|--------|---------|
| 扩增子测序（细菌和真菌） | qPCR和生物标志物?检测面板 | 骨科多种体液、组织、拭子和混合样本；石蜡包埋组织 | 改善慢性伤口愈合率，减少碎石术后感染，减少尿路感染症状，并多样化抗生素的使用 | MicroGen DX | 14, 28, 30, 32, 35 |
| 扩增子测序（细菌、真菌或寄生虫） | qPCR | 多种体液、组织和拭子；石蜡包埋组织 | 华盛顿大学 | 36 |
| 扩增子测序（细菌和真菌） | qPCR | 多种体液、组织和拭子 | 临床管理变更（例如，抗生素降阶梯治疗） | Mayo Clinic | 37 |
| 宏基因组测序 | — | 血液（血浆） | Karius | 38–41 |

\*结果驱动的发现定义为队列研究，如随机对照试验和回顾性研究，比较NGS LDT指导的治疗与标准护理。
?针对符合条件的样本类型（如滑液和尿液）可提供生物标志物检测面板。

图1 NGS工作流程示例，展示一个整合qPCR和NGS技术用于细菌和真菌靶向分析的临床工作流程。此特定示例由MicroGenDX（德克萨斯州拉伯克）的LDTs使用，并在先前的研究中引用。

基于扩增子的方法针对长度在约250至约560碱基对（bps）之间的短DNA片段。33??3???靶标长度通常首先由测序仪（例如，Illumina MiSeq与NextSeq）和试剂盒循环次数（例如，2×250与2×300）决定，其次由所靶向的基因区域决定。例如，Illumina测序仪和试剂盒最适合选择可在其循环选项范围内的靶标，如双端150 bp或250 bp测序。双端测序允许从扩增DNA靶标的两端进行测序，并可以通过重叠的公共区域在生物信息学上进行"拼接"。因此，双端250 bp测序可以产生最大总长度在450至475之间的扩增子。双端测序方法是Illumina和Element Bio平台的一个标志；然而，Oxford Nanopore和Pacific Biosciences等其他新兴平台使用单端测序方法。

接下来，选择一个基因靶标，该靶标确信比最大拼接长度更短。对于确定16S rRNA基因中最佳靶向区域以针对细菌的问题，各种基准研究集中确定哪些区域可以在不同大小的靶标下进行测序，以及哪些靶标组合在区分细菌种方面最具信息量。忽略通过长读长测序或多重引物测序进行完整16S rRNA基因测序的可能性，?????大多数此类研究倾向于将部分16S可变区域V1–V3或V1–V2作为在临床相关样本类型中产生有用物种水平鉴定最具信息量的区域，??????????1具体取决于给定平台可能实现的长度。因此，使用部分16S rRNA测序的临床LDTs倾向于涵盖V1–V2，3???3大多数将其作为最紧凑区域中信息最多的选项，尽管V3–V4也被使用。3?

基于鸟枪法宏基因组的方法不同之处在于其诊断潜力更大，但需要在效率和针对特定样本的优化方面进行权衡。更显著的诊断潜力主要来自对感染性生物体更大遗传组成（即全基因组测序）的测序能力，这可以更有信心地将微生物鉴定到种水平，并可能区分菌株（例如，鉴定具有已知致病性差异的大肠杆菌?2或金黄色葡萄球菌?3的菌株）。虽然通常依赖于75或150 bps之间的短读长测序片段，但这些较短的片段可以通过生物信息学组装成更大的"重叠群"或直接比对到参考数据库中以进行更有信心的鉴定。33此外，通过单次检测表征多个生命域（或感染性生物体）的潜力，如细菌、真菌、寄生虫和病毒3?（取决于实验室制备）。还可能存在鉴定与毒力或抗菌耐受性相关的基因/突变的潜力；然而，这目前主要仅在研究中展示13，并且在宏基因组NGS LDTs中（如果存在的话）目前仅限于狭窄的耐药相关靶标选择。

鸟枪法测序特有的负面权衡主要体现在LDTs提供者在优化特定样本类型方面的挑战、管理更高的数据量以及相关的生物信息学复杂度增加。在NGS可分析的所有可能样本类型中，感染组织和植入物提供的独特挑战与血液或脑脊液??的分析相比有所不同，后者难以回收足够的DNA以进行可靠的分子分析。鸟枪法测序的理想样本将富含目标微生物DNA，或者至少不受大量宿主DNA的干扰，因为宿主DNA而非病原体DNA的测序可能会降低检测效能，11??3???甚至导致宿主DNA与微生物DNA之间的虚假匹配而产生假阳性鉴定。??为克服这些问题，基于鸟枪法的LDTs通常纳入实验室清洁步骤以提高其对微生物DNA的靶向性，?????或专注于DNA浓度传统上较低的样本并使用特殊制备方法，如血液血浆中的游离DNA。3?另一个实际权衡是鸟枪法测序每次运行产生的数据量远大于可比的扩增子测序运行，导致处理和存储此类数据的成本、时间和计算需求增加。尽管存在这些挑战，一些宏基因组LDTs现在可以在收到样本后1–3天内返回可操作的结果。3?

确定"阳性"和NGS的参考标准

区分临床NGS应用和研究应用的一个主要特征是用于确定NGS检测中"阳性"的方法以及何时报告或不报告可能感染性生物体的参考标准。阳性和参考标准用于减少可能报告的假阳性，鉴于NGS分析带来的增强敏感性，这些标准是至关重要的。这些标准的必要性得到强调，因为使用NGS方法处理的一部分临床样本被认为是"低生物量"样本。低生物量样本包括各种样本类型，如传统上被认为是无菌环境和体液（如血液）的样本。对这些低生物量环境的微生物组研究反复强调，这些含有极少宿主或微生物DNA的样本在样本采集或实验室处理过程中存在污染的风险。

此类污染物在这些样本中的检出水平可能高于阳性对照模拟样本。59–61 这引发了关于“正常”微生物居民在血液或羊膜囊等特定环境中持续存在的争议，当更充分地考虑污染因素时，这些环境往往呈现阴性或短暂的结果。62,63 在进入下一代测序（NGS）实验室自建检测（LDTs）的开发阶段，控制假阳性率被公认为是一项必要工作，这也促使了对NGS应使用的对照类型以及“去污”微生物数据最佳计算方法的建议。61,64

对于基于扩增子的NGS，建立样本阳性的常见方法是将检测与匹配的阳性广谱PCR检测相关联，例如终点PCR或qPCR。12,43,65 一个联合工作流程的示例如图1所示。这些检测的基础是，细菌靶细胞数量（即细菌负荷或生物负荷）的增加与感染风险的增加相关，66 通常与具体的微生物无关，而生物负荷可以通过广谱PCR检测进行估算。使用终点PCR时，从临床标本中提取的DNA将针对通用基因靶标（例如16S rRNA）经历标准化的PCR循环次数，该反应产物必须能够在使用凝胶电泳可视化后才能进行测序。使用终点PCR时，相同的扩增产物可以直接进入文库制备以进行测序。对于使用qPCR的LDTs，样本DNA将经过一个单独的广谱16S反应，该反应可定量超过特定阈值的目标DNA拷贝数，或通过特定数量的PCR循环进行扩增，例如少于32个循环视为阳性扩增，37 然后再进入NGS检测的文库制备和测序。通过引物设计和PCR热循环条件（例如所使用的PCR轮数67,68）可以优化灵敏度和特异性。测序后数据处理中的决策也会影响灵敏度和特异性，例如关于读取深度阈值的决策。69 各实验室使用的确切截断值并不总是清晰的，尽管已发表的资料表明，广谱16S和NGS阳性是一种有用的诊断指标，与单独培养相比可提高诊断阳性率。11,43,65,70

接下来，使用单独的参考标准和质量控制过滤器来限制单次检测中报告的物种数量，移除可能作为污染物或测序伪影引入的物种，或基于绝对估算定量为单个物种建立报告阈值。在向临床医生报告时，这些步骤还简化了可交付的输出，将复杂的数据转化为相对简单的答案，使得主治医生不应收到包含样本中数百个独特谱系的报告，这在研究性研究中可能会出现。在处理任何微生物NGS数据的早期阶段，通常会考虑剔除相对于其他序列在极低丰度下检测到的独特序列，这既在运行级别也在样本级别进行。实施此类过滤器在去除由测序错误产生的虚假伪影和样本孔的低水平污染方面是有效的。71 样本特定的相对丰度过滤器通过聚焦样本中最主要的微生物进一步提供帮助，这可能表明在多微生物感染中发现的微生物的治疗优先级。权衡之处在于，有可能遗漏可能曾以高丰度存在但未清除给定百分比阈值（例如2%相对丰度）以被报告的相关细菌。72

用于宏基因组测序的另一种常用策略是估算每个样本中DNA片段或分类群的绝对数量。39,73 为了估算绝对数量，可以使用合成DNA“加标”作为内部阳性对照，以已知浓度引入临床样本，并用于构建标准曲线，从而对每个已识别的分类群或DNA片段进行定量。74 这种方法的一个优势是，它建立了一个框架，其中每个报告的物种都可以独立评估，而不是采用基于样本的阳性判断方法。这种方法的独特挑战通常集中在选择适当的参考靶标（预期不会自然出现在样本中）以及针对定量内部标准中的偏差开发稳健的方案。74 绝对定量方法仅限于基于液体活检的LDTs，如脑脊液和血浆，40,75 这可能表明在其他标本类型中应用该方法会面临困难，使定量更加困难或不可靠。

**NGS对PJI治疗及抗菌药物管理的影響**

NGS的使用可为PJI治疗中的抗菌药物管理提供重大益处。基于药敏测试结果针对已识别病原体进行抗菌治疗是最佳抗菌药物利用的基准。然而，在培养阴性的PJI中，抗菌药物通常基于可能的病原体和当地药敏模式进行经验性给药。76,77 这种方法经常导致广谱抗生素的过度使用，可能导致不良事件，包括艰难梭菌感染、微生物组破坏、耐药性选择和治疗失败，因为即使广谱抗生素也可能无法针对致病菌。78 理想情况下，总是优先识别致病菌，并允许进行病原体导向治疗，这更有可能有效并避免菌药不匹配。

如上所述，已有几份报告说明了NGS在管理PJI方面的益处。11,15 在一项多中心、前瞻性研究中，Goswami等人14 评估了NGS对14家医疗机构301名接受翻修髋关节或膝关节置换术患者管理的影响。术中样本同时送检常规培养和NGS。14 这些患者中，85例（28.2%）为培养阴性。NGS在这些培养阴性患者中识别出病原体的比例为56例（65.9%）。大多数关节中识别出多种微生物。这些发现与先前的研究一致，表明PJI通常是多微生物感染。识别出病原体可能影响抗生素的适当选择。其他报告还证明了NGS识别病原体的能力。Duan等人79 使用NGS在肾移植受者复发性尿路感染患者中识别病原体。NGS在微生物识别方面显著高于培养（100%对比36.6%），并根据这些结果调整了许多患者的抗菌治疗。

Miao等人80 评估了宏基因组NGS（mNGS）与常规培养在511个来自各种感染（最常见为下呼吸道、皮肤软组织或腹腔内感染）标本中的诊断性能，发现mNGS的敏感度显著高于培养。重要的是，对于mNGS阳性但常规方法不明确的病例，61%的病例导致了诊断修改，58%的病例未被经验性抗生素覆盖。对于识别出病毒的病例，常给予广谱抗生素，而许多被认为是不必要的，因为未识别出细菌病原体。

宏基因组下一代测序（mNGS）在205名因社区获得性肺炎入院重症监护室的患者中进行了评估。81 mNGS检测病原体的阳性率为81%，显著高于标准培养方法（56%）。仅由mNGS检测到的病原体包括脓肿分枝杆菌、鹦鹉衣原体、耶氏肺孢子虫和几种病毒。作者得出结论，使用mNGS可帮助临床医生做出更好的患者治疗决策，并需进一步研究以评估其可能改善临床结局和成本效益的情况。

**NGS唯一检测到的微生物的临床意义**

对于学习解读和行动基于NGS诊断报告的医疗服务提供者来说，对于如何处理无法通过更熟悉的检测方法分离的微生物，可能存在犹豫和困惑。许多常见问题围绕某个版本的“这些微生物是否有临床意义，是否需要治疗？”

确定细菌的临床意义及对抗生素治疗的需求是复杂的。通过NGS或PCR简单检测细菌并不一定表明活动性感染。在可能的情况下，应使用结合临床和实验室数据的算法来帮助区分感染、定植和污染。对于PJI，各种诊断标准（例如2018年ICM对PJI的定义）纳入了可通过血清或滑液测量的感染标志物。16,82 尽管承认这些标准可能不完善且各种诊断指标显示可变的一致性，82,83 但这些诊断标准可以成为确定NGS检测到的微生物临床意义的优秀工具。

接下来，了解从标本中回收的细菌负荷的绝对定量测量有助于评估特定微生物的临床相关性。使用传统基于培养的方法，细菌可以通过菌落形成单位（CFU）进行计数，通常在活动性感染期间观察到CFU的增加。如前所述，NGS技术通常与广谱16S rRNA基因qPCR检测或合成加标互补，可用于估算样本内的微生物负荷（或“负荷”）。在确定疑似病原体的临床相关性时，这些微生物负荷的估算值可以视为与CFU估算值类似，并且负荷增加与感染相关。84 虽然像表皮葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌这样的“共生”细菌造成的危害可能值得商榷，但如果以高丰度发现于可能无法耐受如此细菌负荷的空间中，如植入物内，则这些细菌可能正在充当机会性病原体。

考虑两个涉及在翻修手术术中从疑似PJI患者获取的NGS阳性标本的情景。在每种情景中，NGS报告痤疮丙酸杆菌为主要微生物。在第一种情景中，检测伴随高细菌负荷（例如拷贝数>10^7）和升高的生物标志物（例如WBC和PMN%）。在第二种情景中，报告的细菌负荷低（<10^4拷贝数），且仅CRP升高。第一种情景更可能将痤疮丙酸杆菌视为适合针对性抗生素治疗的临床相关病原体，因为细菌负荷升高与活动性感染一致，且伴随的实验室标志物符合PJI的诊断标准。鉴于第二种情景，痤疮丙酸杆菌以低丰度检测到，且缺乏明确的感染实验室标志物。在该情况下检测到痤疮丙酸杆菌可能反映低水平污染或亚临床感染，如果没有明显的感染临床征象，采取观察和等待的方法可能是审慎的。

NGS和qPCR方法已显示出在患者接受抗生素治疗期间识别微生物的有效性，85 且通常认为抗生素治疗不会大幅降低分子诊断方法的敏感度。然而，分子诊断在技术上能够检测可能来自非存活细菌的DNA，86 这在临床上是没有意义的。为了了解假阳性检测死亡细菌的风险，可以进行活力实验，首先使用膜不可渗透染料溴化丙锭（PMA）处理临床标本，该染料可以选择性结合DNA并防止未被活细胞膜“保护”的DNA扩增。理论上，PMA处理的样本应该只扩增与存活微生物细胞相关的DNA。87,88 为了了解培养阴性感染中阳性分子发现的相关性，Lee等人89 在小鼠模型中模拟了培养阴性感染，并使用PMA-qPCR检测证明分子发现识别的微生物很可能是存活的，因此可能具有临床相关性。一项使用PMA-qPCR的观察性研究得出的估计表明，多达27%的培养阴性感染中可以检测到可回收的存活细菌。90 最后，一项在骨科植入物模型中进行的时间序列实验表明，死亡细菌的DNA不会持续存在超过48小时，表明DNA降解和清除发生得足够快，以至于不会成为分子检测假阳性的显著来源。91

总之，确定NGS检测到的病原体的临床相关性可能是一项挑战；然而，治疗医生应将发现与存在的微生物负荷、实验室和临床观察相结合进行权衡。虽然排除死亡细菌DNA的存在可能很困难，但先前的实验表明，死亡细菌的DNA并不能解释培养阴性样本的阳性结果，且非存活DNA在2天内从感染部位清除。

最后，病原体本身也是一个重要的考量因素，但甄别任何NGS可能报告的病原体的致病潜力已超出本综述的范围。

NGS的成本考量

NGS实验室自建检测（LDTs）的费用可能高于传统培养方法，商业检测试剂盒的价格范围为每例350至2000美元（分别为MicroGen DX和Karius的NGS市场报价）。额外成本限制了NGS在常规临床实践中的可及性，但随着对这些工具成本效益认识的加深以及样本池化技术成为NGS应用的可行选择，这一状况可能正在改变。

假体周围关节感染（PJI）和类似骨科感染场景（例如长骨骨折相关感染的术中采样）的常规采样实践通常需要对多个样本进行培养，92–94 导致培养费用更高。例如，术中骨科标本采集的常规操作可能需要每次手术采集3至6个标本（如假体、液体、拭子、组织），然后通过多达4种特殊方法进行独立的培养检测（如抗酸杆菌培养、厌氧培养、真菌培养）。92–94 这一工作流程可能导致每次手术产生多达24个可收费的诊断事件，但鉴于医院不透明的计费方式，设施实际费用较难估算。或者，使用某些NGS应用可将此类标本池化，每次手术的总费用仅为350美元。考虑到样本池化，NGS在实践中有潜力成为一种极具成本效益的工具。

已有研究开始量化NGS与其他诊断方法相比的成本效益。一项评估PJI中NGS应用的研究得出结论：如果诊断方法能达到至少71%的灵敏度和94%的特异度，即使NGS检测价格高达3916美元，NGS仍比培养更具成本效益。95 但他们也报告称，如果仅将NGS用于术前PJI预期概率至少为45.5%的人群，NGS的成本效益最佳。95

证明NGS成本效益的另一条途径是将其作为低检出率、针对苛养菌（如真菌和分枝杆菌）的特殊培养检测的替代方案。在PJI的背景下，真菌感染被认为是罕见的（占所有PJI的不到2%），真菌培养检出率极低，因此得出的结论是由于真菌培养阳性罕见、临床价值可疑且费用高昂，不应常规进行真菌培养。96,97 然而，真菌性PJI也被公认伴随诊断延迟和预后不良。98–100 此外，真菌和分枝杆菌培养的建议包括至少5个标本和较长的孵育时间，93 而NGS可能能在更短的时间内提供相同的答案并减少所需检测数量。对所有细菌（包括分枝杆菌）和真菌进行常规NGS检测是取代特殊培养检测（如真菌培养、分枝杆菌培养）的一种可行替代方案，具有更高效、更具成本效益和更快的优势。

尽管NGS的成本效益和可及性正在改善，但不当实施仍可能造成经济负担。机构实验室管理委员会应与感染病专家合作，优先制定和实施临床使用指南。感染病专家在开具和解读NGS结果方面发挥着关键作用，应积极引导NGS检测的适应性和时机选择。

为确保NGS的及时和适当使用，药物管理项目应明确界定需要进行初始或补充NGS检测的具体临床场景。示例包括NGS检测能够弥补培养灵敏度局限性的情况，如心内膜炎或关节感染病例，或疑似苛养菌（如分枝杆菌或真菌）感染的情况。

这些指南应概述NGS使用的临床背景，并帮助临床医生与微生物学家和感染病专家协作进行适当解读。

NGS的未来发展方向

NGS在PJI诊断中的未来应用有望彻底改变骨科微生物学领域。主要发展方向之一是提高诊断准确性和速度。NGS技术正在快速发展，能够更快速、更精确地鉴定多种病原体，包括细菌、真菌和病毒。通过利用先进的生物信息学工具，未来的NGS平台可能提供实时诊断功能，缩短从样本采集到病原体鉴定的时间。现有的NGS平台已经能够提供与传统培养技术相当甚至更短的周转时间，尤其是在建议孵育时间超过8天的情况下。93 这一加速流程将能够实现及时的靶向抗感染治疗，从而可能改善患者预后并降低与长期住院和广谱经验性治疗相关的医疗成本。

NGS在PJI诊断中的另一个重大进展可能来自宏基因组测序技术的整合。该方法允许对关节内的微生物群落进行全面分析，为传统培养方法可能遗漏的多微生物感染提供见解。随着该技术变得更加可及，宏基因组测序可能成为PJI诊断的常规组成部分，提供对感染全貌的全面了解。此外，未来的NGS技术可能将整合机器学习算法，基于基因数据预测抗微生物耐药模式，从而实现个体化治疗方案。随着技术进步，临床医生、微生物学家和生物信息学家之间的合作将至关重要，以充分发挥NGS的全部潜力，确保其成为抗击PJI的标准可靠工具。

结论

NGS在培养阴性PJI病例中11,14以及在非典型病原体检测中101已展现出独特价值。通过实现病原体的快速精确鉴定，NGS为PJI患者提供了更早、更有效的治疗干预。该技术在检测传统诊断方法通常无法识别的罕见、新发或多微生物感染方面尤为关键。

展望未来，NGS技术的持续进步有望进一步提升其临床实用性。改进的测序技术和更精密的生物信息学工具将有望提高诊断准确性并缩短周转时间。尽管我们对NGS诊断技术的持续发展持乐观态度，但NGS已证明自身是一种成本效益良好的工具，可纳入PJI诊断，为感染管理提供全面的方法。实际上，在初次干预时获取NGS样本并立即申请检测或保存以备后续检测，似乎是合理的做法。将NGS整合到临床实践中不仅有望显著改善患者预后，还能优化医疗工作流程、缩短住院时间并降低总体治疗成本。因此，鉴于NGS对患者护理和整个医疗体系具有变革性影响，应大力倡导将NGS纳入PJI患者的常规诊断方案。