多反射飞行时间质谱（MRT）在COVID-19患者血清样本示范研究中实现高精度代谢物鉴定

《Metabolomics》：Multi-reflecting time-of-flight mass spectrometry enables high-accuracy metabolite identification in a demonstration study using serum samples from COVID-19 patients

准确代谢物鉴定仍然是非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）中的主要挑战，原因在于信号重叠、异构化合物以及质量分辨率不足。多反射飞行时间（multi-reflecting time-of-flight, MRT）平台提供超过200,000半高全宽（Full Width at Half Maximum, FWHM）的质量分辨率和亚ppm质量精度，能够进行详细的同位素精细结构分析。目的：使用一组住院COVID-19患者的部分血清样本，评估MRT平台在鉴定脂质和代谢物中的性能。方法：从Manchester Asthma, Allergy and Thoracic Surgery Biobank的人血清样本中提取脂质和极性代谢物，并使用MRT平台结合数据非依赖采集（data-independent acquisition, DIA）进行分析。结果：MRT平台促进了重叠脂质种类的解析并提高了注释置信度。在试点队列（n=8）中，观察到与疾病严重程度相关的代谢组差异，同时注释了临床相关代谢物，包括硫酸化胆汁酸和与肾功能障碍相关的滞留碘海醇（iohexol）。结论：这些发现表明，MRT平台增强了代谢物鉴定的置信度并支持高通量代谢组学，为临床研究中的生物标志物发现提供了显著潜力。

研究背景与问题。代谢组学、脂质组学以及蛋白质组学等组学方法为研究生物过程提供了信息丰富的途径，可用于疾病生物学、药物毒性、药理学、微生物组等研究。非靶向代谢组学/脂质组学通常依赖高分辨质谱（high-resolution mass spectrometry, HRMS），并结合液相色谱（liquid chromatography, LC）、气相色谱、超临界流体色谱或毛细管电泳等技术。其中LC-MS(MS)结合亚2 μm颗粒LC因样本兼容性、速度、特异性、分析物分辨率和灵敏度而成为常用选择。然而，发现型代谢谱仍面临代谢物覆盖、特征检测、动态范围、定量、峰注释和化合物鉴定等挑战。准确鉴定因重叠信号、异构化合物和质量分辨率不足而困难。生物样本含大量同量异位或结构异构体，数据库搜索常返回多个候选；脂质尤其复杂，如磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine, PC）34:2包含多个结构相关异构体且m/z相同，不同类脂质也可能具有相似m/z，加合物如H⁺、Na⁺、K⁺还可与其他共洗脱脂质重叠。Jones等曾报告，HRMS分辨率约高于150,000 FWHM且质量精度1 ppm时可显著简化数据库搜索。传统高分辨质谱各有局限：离子阱需较长采集时间；飞行时间（time-of-flight, ToF）分辨率依赖离子飞行距离，延长飞行管不切实际且导致信号降低。反射器可多次反射离子，但网格会降低离子传输效率。MRT旨在以较小离子损失显著增加离子路径，提供200,000 FWHM或更高分辨率及高达30 Hz采集率。因此，研究人员开展示范研究，用新型MRT质谱仪分析COVID-19住院患者血清，评估其在真实样本中脂质和代谢物鉴定的性能。

研究开展与总体结论。研究人员从ManARTS（Manchester Allergy, Respiratory, and Thoracic Surgery）Biobank COVID-19队列中选取8例住院患者血清，依据Manchester COVID-19 Severity Score（MCSS）和可得的WHO COVID-19严重程度评分分为“轻症”和“重症”，并开展脂质和极性代谢物分析。研究结论表明，MRT平台通过高分辨率、高精度质量测量和精细同位素分析增强了代谢物鉴定置信度，支持高通量代谢组学，并在小规模真实世界样本中展示了临床生物标志物发现潜力。

关键技术方法概括。样本来源于ManARTS Biobank COVID-19队列的8例住院患者血清，依据MCSS和WHO评分划分为轻症和重症。研究人员提取脂质和极性代谢物，采用ACQUITY UPLC I-class与SELECT SERIES MRT质谱仪，ACQUITY BEH amide柱，正负电喷雾电离（electrospray ionisation, ESI），数据非依赖采集MS^E模式，10 Hz，质量范围50–2400 m/z，编码频繁推斥模式。数据处理使用Progenesis QI、R，数据库搜索采用LIPID MAPS、Metlin MS/MS和Human Metabolome Database（HMDB）；统计采用Wilcoxon秩和检验、Benjamini-Hochberg校正、主成分分析（principal components analysis, PCA）、Ward聚类和MetaboAnalyst 6.0。

研究结果。3.1 使用多反射飞行时间质谱提高质量分辨率：研究人员说明MRT利用反射器（离子镜）电压使离子束沿管长反射，倍增飞行距离，并通过多次反射进一步提高分辨率且尽量减少信号损失。离子经step wave离子导、Q1、碰撞池、无网格反射镜，路径可达47 m，周期透镜重聚焦，微通道板检测器记录到达时间和信号强度。结论是MRT能在不显著增大仪器尺寸的前提下实现高分辨率。3.2 COVID-19感染生物标志物的试点分析：使用8例ManARTS COVID-19血清样本，人口特征以65岁以上、男性、超重或肥胖及显著合并症为主，感染严重程度和临床路径多样。结论是这些样本可用于探索MRT血清代谢组学分析。3.3 与超高效液相色谱分离的兼容性：超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography, U(H)PLC）峰宽仅2–3 s，需5–10 Hz采集8–10个点。FTMS和离子阱需约1 s扫描，而MRT可达20 spectra/s。以10 Hz采集乙酰-L-肉碱（保留时间3.73 min，m/z 204.12303）的6 s宽HILIC峰，获得28个数据点，质量测量稳定。结论是MRT兼容快速LC并具定量分析潜力。3.4 解析共洗脱特征和精细同位素分布：血清代谢物众多，共洗脱不可避免；¹³C、¹⁵N、³⁴S等重同位素可辅助确认分子式。研究人员分析1.5 min共洗脱脂质，PC(34:2) m/z=758.57019，第二个峰m/z=760.58575含两个峰760.57678和760.58575，分辨率达224,770 FWHM；前者为¹³C₂ PC(34:2)，后者可能为PC(34:1)。模拟50,000和100,000 FWHM均无法分辨。质量差a2-a3为1.003 Da，a2-b1为1.013 Da，理论模型与实验一致；钾加合物也解析出PC(34:1)和PC(34:2)的同位素组合。结论是MRT可解析重叠脂质和精细同位素。3.5 COVID-19患者代谢组谱比较：PCA显示患者3重复性差被排除，其余样本注射聚类紧密且无漂移。Kruskal–Wallis检验得到的正离子模式top 100差异特征经Ward聚类热图显示，康复轻症患者2与轻症活动患者6聚类；除患者1外，重症活动患者4、5、7、8特征丰度较低且相似；患者1虽为重症活动感染，却更接近轻症/康复患者，且是唯一非幸存者。结论是在小规模原理验证中观察到疾病严重程度相关代谢组差异。3.6 高精度质量促进人血清化合物注释：多数潜在生物标志物尚未注释。MRT质量误差为21–134 ppb（0.021–0.134 ppm），优于常规QToF的1–3 ppm和quadrupole orbitrap在240,000 FWHM时的1–2 ppm。乙酰-L-肉碱m/z 204.12303的FWHM为162,190，MS¹质量精度0.03 ppm，MS²为0.35 ppm。m/z 597.28739在2 ppm误差下有9个候选，0.5 ppm下仅2个互为异构体的taurochenodeoxycholate sulphate。结论是高精度缩小搜索空间并减少假阳性。3.7 改进化合物鉴定为COVID-19患者代谢组提供见解：7例患者血清代谢组获得注释，包括膜脂和奇数链脂质PE(41:2)、PC(35:1)；患者2中鉴定格列齐特（Gliclazide），与其2型糖尿病临床元数据一致。患者1有152个独特特征，其他患者平均37.5个。5个注释为甘氨熊去氧胆酸（glycoursodeoxycholic acid, GUDCA）、牛磺鹅去氧胆酸硫酸盐（taurochenodeoxycholate sulphate, TCDC sulphate）、sphingofungin A、1-alpha dihydroxy diphenyl dinorvitamin D₃和iohexol。上述发现与患者高胆固醇血症、肾衰竭和近期CT扫描一致；iohexol因肾衰竭清除延迟，TCDC硫酸盐与严重COVID-19和脓毒症相关，sphingofungin A提示Aspergillus fumigatus，原文指出患者1机械通气，存在COVID-19相关肺曲霉病（COVID-19-associated pulmonary aspergillosis, CAPA）的较强可能性。结论是化合物鉴定结果与临床史一致，展示真实世界样本应用。

讨论与结论总结。准确鉴定感兴趣特征正引起代谢组学和脂质组学界显著关注，Theodoridis等指出确保基于事实的代谢物鉴定面临挑战。本文MRT MS平台具有>200,000 FWHM高分辨率和10–20 Hz高速数据采集，促进高分辨率“精细同位素”MS数据采集，使复杂“真实世界”患者样本中脂质和代谢物得以准确鉴定；并可解析常规ToF或静电阱仪器无法检测的重叠脂质种类。高精度质量测量显著限制搜索空间，减少假阳性。该平台能鉴定危重COVID-19患者循环中与临床史一致的化合物。虽然研究仅来自较大ManARTS COVID-19队列的小亚组，但提供了MRT平台用于“真实世界”样本代谢物分析的原理验证。大规模、快速、详细分析对揭示疾病代谢失调、识别诊断和预后生物标志物及治疗靶点至关重要；本研究未完全解决大型代谢组学挑战，但高质量MS¹和MS²谱表明MRT可提高准确特征鉴定机会，同时满足临床和流行病学大型队列所需的高通量分析。

研究结论翻译。感兴趣特征的准确鉴定正引起代谢组学和脂质组学界的显著关注，Theodoridis等最近的出版物说明了在确保基于事实的代谢物鉴定中面临的挑战。此处描述的MRT MS平台具有高MS分辨率（>200,000 FWHM）和高速（10–20 Hz）数据采集，促进了高分辨率“精细同位素”MS数据的采集，其采集速度允许在复杂“真实世界”患者样本中准确鉴定脂质和代谢物。它显示了获取精细同位素细节的能力。这允许解析和鉴定重叠脂质种类，否则用常规ToF或静电阱型仪器将无法检测。提供高精度质量用于化合物鉴定的能力显著限制搜索空间，因此减少报告的假阳性数量。该平台能够鉴定危重COVID-19患者循环中存在的化合物，提供了对其状况的见解，并与患者临床历史一致。虽然这项研究仅在较大ManARTS COVID-19队列的一小部分中进行，但它提供了MRT平台应用于“真实世界”样本中进行代谢物分析的原理验证演示，这些样本因众多未控制变量而复杂。能够大规模且快速地进行如此详细的分析对于揭示疾病中代谢失调以识别诊断和预后生物标志物以及治疗靶点至关重要。虽然这项小型研究没有完全解决与更大型代谢组学研究相关的挑战，但本研究中获得的高质量MS¹和MS²谱表明，诸如MRT平台的技术可以显著提高准确特征鉴定的机会，同时允许临床和流行病学研究中有足够把握度的大型队列所需的高通量分析。