木霉属微生物的化学蓝图：下一代微生物生物刺激剂的代谢组学与菌群兼容性评估

《Metabolomics》：The chemical blueprint of Trichoderma for next-generation microbial biostimulants

微生物生物刺激剂（microbial biostimulants）包含有益微生物，如芽孢杆菌属（Bacillus）和木霉属（Trichoderma），它们通过生物学机制促进植物生长、养分吸收和胁迫耐受性。芽孢杆菌与木霉的联合使用日益被认为是提高作物生产力和实现可持续农业的重要策略。然而，微生物的兼容性受限于其独特的生态位和代谢活动，这可能限制菌群的稳定性。本研究旨在表征木霉菌株的生化图谱，并评估其与芽孢杆菌菌群的代谢兼容性。研究人员采用LC–MS级甲醇从每个木霉菌株中提取代谢物，并通过UPLC–MS系统对甲醇提取物进行分析。利用主成分分析和正交偏最小二乘判别分析评估木霉菌株间的样本聚类和整体代谢变异。采用基于特征的分子网络（Feature-Based Molecular Networking, FBMN）对木霉的化学空间进行代谢物注释，并通过功能分析将注释代谢物映射至木霉菌株的代谢通路中。结果显示，研究发现了包括初级和次级代谢物在内的独特代谢标志物，其中鞘脂代谢（sphingolipid metabolism）受到显著影响。体外研究表明，木霉菌株与芽孢杆菌菌群之间存在正向相互作用，未发现拮抗证据。生物刺激剂应用的主要制约因素是产品组成缺乏标准化。因此，这些发现为微生物网络的分子组成和功能动态提供了见解，这类知识对于开发生物刺激剂领域的尖端创新至关重要。

研究背景与问题

可持续农业追求在不导致土地退化或破坏资源的前提下实现高产。利用农用有益微生物，例如有益真菌木霉属（Trichoderma）和促生根际细菌芽孢杆菌属（Bacillus），能为农业系统带来稳定性。将木霉与芽孢杆菌共接种可能产生协同作用，增强微生物活性和功能表现，从而在养分溶解、微生物持久性和抑制病原菌方面优于单接种。然而，微生物的兼容性受限于它们不同的生态位和代谢活动，这可能会限制菌群的稳定性。在制剂层面，维持微生物在储存、运输和田间施用过程中的活力面临货架期短和载体技术不足等障碍；规模化生产从实验室成功转向经济高效的工业发酵和制剂也充满挑战；田间效果常因与本地土壤微生物群、环境因素和作物特定条件的相互作用而波动巨大；此外，监管限制和农民认知不足也阻碍了微生物制剂的推广。因此，亟需深入理解微生物的代谢机制，以预测和优化兼容的微生物组合。

研究内容与结论

研究人员对棘孢木霉（T. asperellum, TA）和哈茨木霉（T. harzianum, TH）两种木霉菌进行了比较性的非靶向代谢组学分析，并结合体外实验评估了它们与一个商业芽孢杆菌菌群产品（Bacstim?100）的兼容性。研究发现，两种木霉具有截然不同的代谢特征，差异主要集中在氨基酸、吲哚类和脂质代谢物上。功能分析显示鞘脂代谢通路受到显著影响。体外兼容性测试表明，TA和TH均能与芽孢杆菌菌群共存，未观察到明显的拮抗作用，表现为可兼容的加性生长效应。这项研究的重要意义在于为木霉的化学成分提供了新的认识，揭示了种间特异的化学特征和代谢途径，并建立了化学特性与菌群兼容性之间的关联框架，为合理选择微生物、开发多菌种复合生物刺激剂提供了理论基础和候选化学标记物。

关键技术方法

1. 1.
   非靶向代谢组学分析：使用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）系统对两种木霉（TA和TH）的甲醇提取物进行数据采集。样本来源为南非科学与工业研究理事会（CSIR）提供的粉末状真菌生物质材料。
2. 2.
   多元统计分析与代谢物注释：运用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）区分代谢谱差异；采用基于特征的分子网络（FBMN）结合GNPS2平台和MassBank数据库进行代谢物注释，达到代谢组学标准倡议（MSI）第2级。
3. 3.
   功能与通路分析：利用MetaboAnalyst软件将所有注释代谢物映射到黑曲霉（Aspergillus niger）的KEGG通路库中，进行通路富集和拓扑分析。
4. 4.
   微生物兼容性测试：在半强度马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）和胰酪大豆胨肉汤（TSB）培养基中进行TA、TH与芽孢杆菌菌群的共培养实验，并通过双平板对峙法和发酵液试验评估拮抗作用。

研究结果

3.1 棘孢木霉与哈茨木霉的全局代谢蓝图

非靶向代谢组学揭示了TA和TH之间的显著分离，表明两者具有不同的代谢谱。PCA和OPLS-DA模型均显示出清晰的组间分离和良好的统计可靠性。共检测到3215个特征，其中42个被推定为MSI第2级代谢物，17个被选为关键的判别变量。这些代谢物主要属于芳香族氨基酸、吲哚衍生物和脂质代谢物三类。TA的特征是色氨酸、苯丙氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酸、鞘氨醇和植物鞘氨醇水平升高；而TH则积累更高水平的酪氨酸、鸟苷、色胺和亚油酰乙醇酰胺。

3.1.1 棘孢木霉与哈茨木霉的差异代谢谱

结果表明两种木霉拥有各自独特的代谢组学特征。TA中色氨酸和苯丙氨酸水平较高，而TH中酪氨酸水平较高。TH中色胺和吲哚-3-乙醛的富集表明其色氨酸代谢下游途径更活跃，这可能与吲哚-3-乙酸（IAA）的合成有关。谷氨酸在TA中含量更高，而精氨酸在TH中更高，暗示两者在氮代谢策略上存在差异。脂质衍生代谢物也促进了菌株分化，TH中亚油酰乙醇酰胺（LE）水平更高，而TA中13-氧代-十八碳二烯酸（13-OxoODE）水平更高，这些脂质可能与膜相关的应激反应和细胞稳态有关。

3.1.2 棘孢木霉与哈茨木薯的功能分析：差异生物学通路

通路分析表明，多个代谢通路显著富集，包括鞘脂代谢、嘌呤代谢、苯丙氨酸代谢等。其中，鞘脂代谢通路的影响最为显著，主要由TA中升高的植物鞘氨醇和鞘氨醇驱动。鞘脂在真菌的细胞分裂、菌丝形成和孢子萌发等过程中发挥关键作用，TA中这些物质的升高可能与其增强的膜稳定性和环境适应能力有关。

3.2 木霉菌株与芽孢杆菌菌群的兼容性评估

共培养实验表明，TA和TH与芽孢杆菌菌群（B）兼容。在PDB培养基中，共培养显著增加了总生物量，但这被解释为兼容性下的加性生长效应而非真正的协同作用。在TSB培养基中，生长曲线显示共培养条件下的增殖相当或略有改善。双平板分析法证实了极小的拮抗作用，TA在第3天观察到的短暂抑菌圈在第10天消失，表明恢复和共存。发酵液试验也未显示任何生长抑制或代谢活性抑制的证据。这些结果表明，在测试的培养条件下，TA、TH和B能够维持稳定的生长动态，这对于开发稳定有效的微生物菌群至关重要。

总结讨论与研究结论

该研究通过整合代谢组学表征与兼容性评估，不仅区分了两个木霉物种的化学特征，还将其化学特性与在多微生物系统中的适用性联系起来。从生物刺激剂开发的角度看，这些化学信息有助于建立微生物材料表征、菌株和菌群选择、产品开发及未来质量评估的知识基础。鉴定出的判别代谢物可作为候选化学标记物，用于区分基于木霉的材料并监测其组成一致性。然而，这些标记物的实际应用需要在更多菌株、生产批次和独立样本集中进行验证。

研究结论：本研究通过比较性非靶向LC-MS/MS代谢组学、多元分析、分子网络和通路分析，扩展了对棘孢木霉和哈茨木霉的化学认知。两个物种展现出不同的代谢组学特征，关键差异主要与氨基酸、吲哚和脂质代谢相关。这些发现为区分两种木霉材料提供了生化基础，并补充了与真菌生理和环境适应相关的种间化学特征及代谢过程信息。重要的是，化学表征与对一个定义的芽孢杆菌菌群的兼容性实验评估相辅相成。在测试的培养条件下，棘孢木霉和哈茨木霉均能与芽孢杆菌菌群共存，未发生实质性拮抗作用。在某些共培养中观察到的总生物量增加与兼容性和加性生长一致，而非证明的微生物协同作用。代谢组学表征与兼容性评估的结合，通过将木霉材料的化学特性与其在多微生物系统中进一步评估的适宜性联系起来，提供了超越物种分化的信息。