《Journal of Neural Transmission》：Association between BDNF methylation and expression of the NLRP3 inflammasome in the brain is disrupted in Alzheimer’s disease
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NLRP3炎症小体（NLRP3 inflammasome）通路的激活与脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的功能障碍均与阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的发病机制相关。尽
NLRP3炎症小体（NLRP3 inflammasome）通路的激活与脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的功能障碍均与阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的发病机制相关。尽管体外和体内模型支持上述机制，但鲜有研究探讨二者在人类脑组织中的关系，以及这种关系在AD大脑中是否发生异常。研究人员对AD患者和对照受试者死后获取的颞叶皮层组织进行了分析，检测了NLRP3通路相关基因（NLRP3、PYCARD、CASP1）、钾通道THIK1（KCNK13）以及相关促炎细胞因子（IL-1β、IL-18）的表达。同时测定了BDNF mRNA表达及BDNF外显子IV启动子区的DNA甲基化水平，并探讨了上述BDNF指标与NLRP3相关基因之间的相关性。在对照受试者中，BDNF mRNA表达与平均甲基化水平之间存在显著相关性，而在AD组中该相关性消失。在对照组中，BDNF表达和平均BDNF甲基化均与NLRP3、CASP1和IL1B存在显著相关性，但这些相关性在AD组中均丧失。AD组还显示出KCNK13表达与两项BDNF指标均存在显著相关性，而对照组中未见此现象。该研究表明，以NLRP3炎症小体组分及促炎细胞因子产物为指标的BDNF与NLRP3激活之间的关系在AD中遭到破坏。AD中BDNF指标与KCNK13表达之间出现的相反相关性（KCNK13已被证实表达升高）提示该发现可能与BDNF功能障碍有关。上述发现加深了研究人员对AD病理生理学的理解，凸显了理解神经炎症-神经营养平衡在神经退行性过程中的重要性。
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种神经退行性疾病，是老年人群痴呆的主要病因。β-淀粉样蛋白（amyloid beta，Aβ）聚集体和含磷酸化tau蛋白的神经原纤维缠结的细胞内沉积是该病的特征性病理标志。然而，这种蛋白病变与导致严重神经元损伤和死亡的神经退行过程之间的关系及其机制仍不清楚。除淀粉样级联和tau过度磷酸化外，神经炎症、氧化应激和神经递质系统功能障碍等多种因素共同参与神经退行过程。这些已知及尚未发现的病理机制之间可能相互交织，增加了理解神经退行性机制的难度，也为治疗开发带来挑战。
在AD中可能具有重要作用的炎症机制之一是NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体（NLRP3 inflammasome）的激活。该炎症小体由三种蛋白组成：胞浆传感器分子NLRP3、含caspase激活募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白（ASC，由PYCARD基因编码）以及效应分子半胱氨酸蛋白酶pro-caspase-1（CASP1）。ASC与NLRP3的组装为激活pro-caspase-1提供了平台，导致caspase-1募集、寡聚化及随后的酶原激活。caspase-1对pro-白细胞介素的切割可产生成熟的、具有生物学活性的IL-1β和IL-18。尽管体外和体内模型系统为NLRP3的参与提供了有力支持，但研究人员此前报道AD与对照脑组织中NLRP3通路各组分的基因表达无显著差异。然而，由NLRP3炎症小体介导的导致炎症增加的功能障碍，仍可能是AD神经退行过程的潜在机制。
脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）同样与AD相关。BDNF参与神经元的存活、发育和功能维持，也是突触可塑性的关键因子，因此在学习和记忆过程及其功能障碍中具有重要作用。BDNF耗竭与AD的多项病理标志相关，尤其是tau磷酸化和Aβ积累，以及神经炎症和神经元凋亡。BDNF表达及其调控机制的异常因此受到广泛关注。
DNA甲基化是一种表观遗传机制，涉及向DNA分子添加甲基基团，通常导致基因沉默。在AD背景下，BDNF基因甲基化改变已被观察到；BDNF启动子区域甲基化增加与AD中基因表达降低相关，这一现象在脑组织和外周血中均有报道。尽管存在一些阴性报道，但这种高甲基化已被提出作为BDNF下调的机制之一，加剧AD中的神经元功能障碍和认知缺陷。AD中BDNF DNA甲基化改变的机制尚未完全阐明，但可能涉及氧化应激、炎症以及DNA甲基转移酶等甲基化相关酶的失调。慢性炎症作为AD的标志性特征，可影响表观遗传修饰，导致影响神经元健康和功能的基因表达改变。
炎症可对BDNF功能产生影响，炎症刺激可导致BDNF减少，进而可能损害神经元功能完整性。炎症与BDNF之间的相互作用延伸至涉及NLRP3炎症小体的机制。在本研究中，研究人员检测了AD和对照受试者死后脑组织中BDNF调控序列的表达和DNA甲基化及其与NLRP3通路组分表达的关系，包括NLRP3、PYCARD、CASP1、KCNK13（编码上游调控钾通道THIK1，该基因表达此前已被证实在AD中升高）以及IL1B和IL18（caspase-1激活的下游促炎细胞因子基因）。
研究人员利用来自曼彻斯特脑库的AD患者和匹配对照的死后颞叶皮层脑组织样本，共纳入78例AD和37例对照样本。AD病例均具有痴呆的临床诊断，并根据Braak分期被定义为中度或晚期AD。对照组与AD组在年龄、性别和死后间隔方面密切匹配。研究采用逆转录半定量实时荧光定量PCR（RT-qPCR）定量RNA表达，参照MIQE指南执行，使用TRIzol提取总RNA，经逆转录合成cDNA后，以SYBR Green进行PCR扩增，所有样本设三复孔。DNA甲基化分析采用QIAamp DNA Mini Kit纯化基因组DNA，经EpiTec Fast DNA Bisulfite Kit进行亚硫酸氢盐转化后，对BDNF外显子IV启动子中含转录因子结合位点的序列进行PCR扩增，利用PyroMark Q48 Autoprep测定四个CpG位点的甲基化百分比。统计分析采用SPSS v30，使用Spearman秩相关检验识别显著相关性，t检验或Z检验用于组间差异或相关性比较。
研究结果显示，AD组BDNF mRNA平均表达高于对照组但未达统计学显著性（p=0.36）。BDNF DNA甲基化在两组间亦无显著差异，但AD组呈现非显著降低，尤其在包含CREB转录因子识别位点的CpG2位点。在对照受试者中，平均甲基化与BDNF表达呈显著正相关（Spearman rho=0.383；p=0.030），主要反映在CpG2位点的效应，但这一相关性在AD组中消失（rho=?0.169；p=0.185），两组相关系数差异显著（Z=2.54；p=0.011）。
在对照受试者中，BDNF mRNA表达与NLRP3和CASP1呈正相关，与IL1B呈负相关。这些与NLRP3、CASP1和IL1B的相关性在AD组中全部丧失，其中CASP1在AD组中显示负相关且组间相关性差异显著。KCNK13在对照组中与BDNF表达呈非显著负相关，而在AD组中呈现显著不同且正相关的模式。BDNF平均甲基化与NLRP3相关基因表达的相关性分析显示，对照组中与NLRP3、CASP1、IL1B和IL18的显著相关性在AD组织中全部丧失，其中NLRP3和IL18的相关性组间差异显著。KCNK13与BDNF甲基化的显著相关性仅在AD组中出现。探索性回归分析显示，对照组中NLRP3相关基因表达对BDNF甲基化存在高度显著的关系（F=5.960，p<0.001），而这一关系在AD中丧失（F=1.172，p=0.138）。
这些发现证明了人脑中BDNF转录相关指标——启动子DNA甲基化和基因表达——与NLRP3相关基因表达之间存在关联。这些在年龄一致的正常神经病理学个体死后颞叶皮层脑组织中观察到的关系，在AD受试者的组织样本中似乎丧失。值得注意的是，这些变化发生在BDNF指标和NLRP3基因表达均无显著改变的背景下。一个例外是THIK1基因KCNK13的表达，该基因在对照受试者中与BDNF表达呈反向关系倾向，而在AD组织中显示强烈正相关，后者也反映在与BDNF甲基化的关联中。研究人员主要采用秩相关分析作为保守方法以避免参数分析的假设，线性回归分析进一步证实了发现：对照组中六个NLRP3基因表达与BDNF甲基化之间存在高度显著的关系，而这一关系在AD中丧失。
既往研究在AD患者脑组织和外周血中发现了BDNF蛋白和mRNA表达的显著降低，且与认知衰退和AD特征性神经元丢失相关。然而，关于BDNF水平的报道存在不一致，包括脑内升高和AD患者血BDNF浓度升高等相互矛盾的发现。一种解释认为这种升高可能反映BDNF的补偿性激活和/或释放，但血浆和血清中BDNF的测量易受多种人为因素影响，且外周BDNF来源多样，提示血液浓度及其变化并非仅与中枢神经系统功能相关。
研究人员此前报道AD颞叶皮层中NLRP3组分表达与对照无显著差异，但观察到胶质纤维酸性蛋白（GFAP，星形胶质细胞激活标志物）升高。研究人员还发现AD脑中KCNK13表达升高及相应的KCNK13启动子甲基化降低。本研究中BDNF基因表达与BDNF甲基化之间存在显著正相关，这一发现出乎意料，因为甲基化增加通常被认为抑制转录。然而值得注意的是，较低的BDNF甲基化和增加的BDNF表达均与NLRP3和CASP1表达增加及IL1B表达降低相关。虽然生活事件可能影响BDNF甲基化，但炎症状态的改变似乎可与BDNF甲基化并行发生，提示炎症对BDNF甲基化可能存在影响。
无论其潜在机制如何，这些在相对不受神经退行过程影响的年龄匹配对照脑组织中观察到的BDNF与炎症因子之间的"正常"关系在AD脑中丧失。这一效应在BDNF表达和甲基化的相关性中均明显，表明炎症活性指标与保护性神经营养因子BDNF之间的正常（推测为稳态）关系遭到破坏。值得注意的是，KCNK13表达的关系与NLRP3及其相关基因的关系方向相反。研究人员此前已证明KCNK13表达在AD脑组织及AD动物模型中被激活。这一编码THIK1（参与NLRP3炎症小体功能调控）的离子通道基因在AD脑中上调，且研究发现BDNF参与了这一过程——该参与在对照受试者中不存在——尽管因果关系尚不清楚。
本研究存在诸多局限性。死后脑组织中基因表达测量受RNA降解影响，这可能无法通过同时测量的看家基因表达完全准确补偿，这也是研究人员选择研究相对稳定的DNA甲基化作为BDNF基因表达潜在相关指标的原因之一。但所有报告指标均未显示与死后间隔显著相关。未来研究蛋白产物将是验证这些发现的有价值方法。研究仅局限于一个受AD相关变化严重影响的脑区，未来纳入其他区域（尤其是海马）的研究将更具信息性。样本量对于死后研究而言较为可观，且大脑均经过神经病理学评估，但死亡原因和濒死状态等因素未被考虑，可能影响测量结果，尤其对RNA影响显著。
关于这些发现仍有诸多待解问题。目前尚不清楚因果方向：在正常大脑中，BDNF表达的控制是对炎症小体激活的响应，还是反之。两种过程均有证据支持，BDNF表达与脑内炎症变化之间可能存在动态相互关系。尽管本研究具有初步性质并提出了各种未解问题，对照脑中观察到的关系为人类大脑中BDNF功能与先天免疫反应相关神经炎症活动某一侧面之间的相互关系提供了证据。这种关系在AD中的丧失确定了该疾病神经功能破坏的一个新特征；理解其具体潜在因素可为缓解AD慢性炎症过程后果提供新的干预机会。
