《Journal of Neuro-Oncology》：Early experience with cerebrospinal fluid cell-free DNA molecular profiling in a neuro-oncology practice
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目的：脑脊液（CSF）游离DNA（cfDNA）作为神经肿瘤学中的液体活检手段，越来越多地被用于诊断病因不明的病变、区分疾病进展与假性进展，以及排除软脑膜病（LMD）。研究人员评估了所在机构在神经肿瘤实践中，利用一种新型CSF cfDNA分子检测方案在上述适应证
目的：脑脊液（CSF）游离DNA（cfDNA）作为神经肿瘤学中的液体活检手段，越来越多地被用于诊断病因不明的病变、区分疾病进展与假性进展，以及排除软脑膜病（LMD）。研究人员评估了所在机构在神经肿瘤实践中，利用一种新型CSF cfDNA分子检测方案在上述适应证中检测变异等位基因（VA）和拷贝数改变（CNA）的早期经验。
方法：自2021年8月起，临床医生可为临床指征明确的腰椎穿刺申请研究性CSF cfDNA测序。提取cfDNA后，进行靶向二代测序（NGS）和/或低深度全基因组测序（LPWGS）。按适应证汇总VA和CNA的结果，并将其与临床特征、cfDNA产量、匹配的组织数据以及总生存期进行综合分析。
结果：共分析了来自76例连续患者的CSF样本，并回顾性地将其分为三类：病因不明的病变（46%）、中枢神经系统进展疑问（21%）以及排除LMD（26%）。cfDNA产量的中位数为0.27 ng/mL（IQR = 0.05–0.61 ng/mL）。在20例患者（26%）中检出VA和/或CNA（以下称为“肿瘤阳性信号”），29例患者（38%）为肿瘤阴性信号，27例患者（36%）因cfDNA产量/质量不足而无法分析。拷贝数负荷阈值7.42可准确识别肿瘤特异性CNA（AUC 0.998），并与较差的总生存期相关（HR 3.4, p = 0.006）。肿瘤阳性信号患者的总生存期显著低于肿瘤阴性信号或低产量患者（p = 0.003）。
结论：尽管CSF中cfDNA丰度较低，但CSF NGS和LPWGS仍能为多种神经肿瘤学适应证提供有价值的信息。目前正在进一步优化适用于低输入量CSF cfDNA的检测方案。
一、研究背景与问题
中枢神经系统恶性肿瘤（如胶质瘤和中枢神经系统转移瘤）通常只能在手术活检或切除时获取组织样本。磁共振成像（MRI）虽广泛用于疾病诊断和监测，但在多个关键神经肿瘤学诊断问题上存在局限性。对于新发现的中枢神经系统病变，不同疾病实体（如高级别胶质瘤与原发中枢神经系统淋巴瘤）可能呈现相似的影像学表现，导致MRI难以确诊。组织取样虽是确诊金标准，但伴随颅内出血、卒中或损伤功能区脑功能的风险，且高达10-15%的病例活检无诊断结果。另一个未满足的需求是区分真正的肿瘤进展与治疗相关性改变（如放射性坏死或假性进展），而常规MRI鉴别疾病进展的敏感性和特异性较差（约30-70%）。此外，软脑膜病（LMD）的诊断同样困难，因为即使患者出现显著的临床恶化，CSF细胞学阳性的频率仍然很低。针对这些临床困境，脑脊液（CSF）游离DNA（cfDNA）测序被提出作为一种液体活检工具，因其更接近肿瘤病灶，有望解决上述难题。虽然多项研究已报道CSF cfDNA在特定适应证中的性能，但较少有研究报告其在真实世界神经肿瘤实践中面对多样化患者群体的部署经验。因此，研究人员于2021年起在其机构内以研究为基础，面向神经内科、肿瘤科和神经外科提供一种新的CSF cfDNA测序方案，并在此报告其涵盖多种适应证的早期真实世界经验。
二、研究方法与技术
研究人员对2021年8月至2024年12月期间梅奥诊所（Mayo Clinic）收治的76例患者的腰椎穿刺CSF样本进行分析。所有样本均来源于临床指征明确的腰椎穿刺，并在知情同意后纳入研究。cfDNA提取使用QIAamp循环核酸试剂盒（Qiagen），随后根据cfDNA浓度和质量选择进行靶向二代测序（NGS）（采用PredicineCARE 152基因杂交捕获面板）和/或低深度全基因组测序（LPWGS）（采用PredicineSCORE检测）。NGS用于检测单核苷酸变异、小插入/缺失、拷贝数改变和基因融合；LPWGS则用于推导全基因组拷贝数谱和拷贝数负荷（CNB）评分。测序在Illumina NovaSeq 6000平台上进行。数据分析包括基于ichorCNA算法的拷贝数分析和基于严格阈值的体细胞变异调用。
三、研究结果
1. 患者队列概况
76例连续患者的腰椎CSF样本被回顾性分为三类：病因不明的神经系统病变（35例，46%）、中枢神经系统（CNS）进展vs治疗相关性改变的疑问（21例，28%）以及排除LMD（20例，26%）。CNS进展队列主要由胶质瘤患者组成（61.9%），而LMD队列多数患者有已知的系统性癌症（70.0%）。影像学上，81.6%的患者存在MRI增强病灶。
2. 跨临床适应证的肿瘤信号检出
肿瘤阳性信号定义为可检出的变异等位基因（VA）和/或拷贝数改变（CNA）。总体而言，20例（26.3%）为阳性肿瘤信号，29例（38.2%）为阴性，27例（35.5%）因cfDNA产量低而无法分析。各适应证的检出分布相似：CNS进展组阳性率23.8%，LMD组25.0%，未知诊断组27.0%。阳性肿瘤信号的CSF样本具有更高的cfDNA浓度（中位数0.91 ng/mL），而阴性或低产量样本分别为0.30 ng/mL和0.00 ng/mL，表明VA或CNA检出与cfDNA浓度相关而非CSF体积。
3. 染色体改变与变异等位基因分析
通过LPWGS检出的染色体改变具有高度异质性，包括1p/19q联合缺失（见于3级少突胶质细胞瘤患者）以及7号染色体获得和10号染色体丢失（见于已知胶质母细胞瘤患者），这与这些肿瘤的分子诊断标准一致。总体而言，LMD和CNS进展队列的染色体复杂性高于未知诊断队列。研究人员确定了7.42的CNB阈值，可最优区分CNA阳性与阴性样本（AUC 0.998），且CNB≥7.42的患者总生存期显著更差（HR 3.37, p=0.006）。在12例接受NGS检测的样本中，10例检出VA，包括TP53、APC、TERT、BRAF、IDH1和MYD88等肿瘤相关突变。在3例同时有组织NGS数据的患者中，CSF和组织之间存在共享和私有的突变。
4. 肿瘤信号与总生存期的关联
在所有CSF分析原因中，阳性肿瘤信号患者的总生存期显著低于阴性或低产量患者（p=0.003）。这一发现在未知诊断组中达到统计学显著性（p=0.024），在排除LMD组中呈非显著性趋势（p=0.083）。而在CNS进展vs治疗相关性改变组中，各组间未见总生存期差异，这可能反映了该队列中复发性肿瘤负荷与治疗相关性改变比例的多样性。
四、讨论与结论
讨论部分指出，由于脑肿瘤常只能通过侵入性神经外科手术获取，基于cfDNA的液体活检在疾病诊断和监测方面具有重要意义。与颅外肿瘤不同，血浆cfDNA在中枢神经系统肿瘤患者中的应用受到血脑屏障的限制，而CSF cfDNA因其更靠近肿瘤而具有优势。本研究的检出率（26.3%阳性）低于既往报告（53-67%），这很可能反映了本研究更广泛的转诊基础，包括大量诊断不确定性高的患者（如未知病因病变和排除LMD）。尽管如此，CSF中cfDNA丰度低和阴性肿瘤信号是显著的良好预后指标，尤其在未知诊断或排除LMD队列中，这与非中枢神经系统肿瘤的诊断相符。
研究结论：尽管CSF中cfDNA丰度较低，CSF NGS和LPWGS仍能为多种神经肿瘤学适应证提供有价值的信息。目前正在进一步优化适用于低输入量CSF cfDNA的检测方案。
