基于糖聚合物的可调聚电解质含量一维三嵌段纳米纤维用于调控细胞相互作用与紫杉醇递送

《Chemical Science》：Glycopolymer-based nanofibers with tunable polyelectrolyte content for modulating cellular interactions and drug deliveryOpen Access

基于聚合物的纳米颗粒（polymer-based nanoparticles）正在成为一类有前景的纳米药物（nanomedicines），但通常局限于球形形态，且对粒径控制有限。由于纳米颗粒形态、尺寸、分散性（dispersity）和表面化学（surface chemistry）决定其生物学性能，因此开发能精确控制这些参数的纳米颗粒对于设计下一代纳米药物至关重要。在此，研究人员报道了具有双功能冠层（dual-functional corona）的一维三嵌段纳米纤维（one-dimensional triblock nanofibers），其结合了聚果糖糖聚合物（polyfructose glycopolymer）的最低细胞毒性和多胺聚电解质（polyamine polyelectrolytes）改善的细胞相互作用。活体结晶驱动自组装（living crystallization-driven self-assembly，living CDSA）能够将聚（芴三亚甲基碳酸酯）-b-聚果糖（poly(fluorene trimethylene carbonate)-b-polyfructose，PFTMC-b-PFr）纳米纤维的长度和分散性精确控制在46 nm至1.15 μm，并在水中具有优异的长期胶体稳定性。随后，这些纳米颗粒负载抗癌药物紫杉醇（paclitaxel，PTX），并研究其向MDA-MB-231乳腺癌细胞的递送。测得IC₅₀值低至0.038 μg mL^?1，优于游离紫杉醇。流式细胞术（flow cytometry）和共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM）显示，所有结晶性三嵌段纳米纤维均被乳腺癌细胞内化。仅含胺基冠层的纳米纤维表现出优异的细胞摄取和低溶酶体蓄积，但细胞毒性增强；而含有中心聚果糖链段的双功能纳米纤维发生细胞摄取，具有中等溶酶体蓄积和最低细胞毒性。这些结果强调，活体CDSA赋予的尺寸、序列和表面化学的精确控制允许系统调节纳米颗粒的生物学性能，从而将结晶性三嵌段纳米纤维确立为未来药物递送系统设计的平台。

论文解读

研究背景：基于聚合物的纳米颗粒（polymer-based nanoparticles）因其易化学修饰、高胶体稳定性和被动或主动靶向特定细胞类型的能力，成为疾病治疗中新兴的纳米药物（nanomedicines）。然而，进入临床试验的聚合物纳米颗粒相对较少，且常局限于球形。部分原因是聚合物纳米药物中纳米颗粒形态和尺寸分布的可重复性挑战，这些性质影响其生物效应，并导致体内与体外活性差异。因此，精确控制表面电荷、表面化学、尺寸、形状和分散性对改善纳米医学性能至关重要。两亲性二嵌段共聚物（diblock copolymers，BCPs）具有疏溶剂核形成嵌段和亲溶剂冠形成嵌段，可通过加入嵌段选择性溶剂自组装成核-壳纳米颗粒。具有无定形核形成嵌段的BCP主要自组装成纳米球和囊泡，而结晶核形成嵌段可获得一维（1D）纳米纤维或二维（2D）纳米片。活体结晶驱动自组装（living crystallization-driven self-assembly，living CDSA）的种子生长可实现低分散纳米颗粒的尺寸控制，并已应用于可生物降解BCP。具有相同核形成嵌段但不同冠化学的BCP顺序活体CDSA可产生空间限定功能的分段纳米结构。高纵横比纳米纤维相比球形纳米颗粒具有延长循环时间、优异细胞摄取和肿瘤穿透等优势。结晶1D纳米纤维在治疗递送、抗菌、生物成像和组织工程中显示潜力。此前研究人员报道了阳离子聚（芴三亚甲基碳酸酯）-b-聚（2-（二甲氨基）乙基甲基丙烯酸酯）（PFTMC-b-PDMAEMA）纳米纤维，具有长度依赖的核酸递送和抗菌活性。PDMAEMA在水中部分质子化（pKa=7.5，约50%质子化），可实现核酸复合、与阴离子细胞膜相互作用和内体逃逸，但导致细胞毒性和表面电荷依赖的细胞摄取，形成效力与细胞毒性之间的权衡。中性或阴离子纳米颗粒通常细胞毒性较低，但细胞相互作用有限。糖聚合物（glycopolymers）可引入碳水化合物功能，促进与细胞表面受体相互作用并维持无明显细胞毒性。癌细胞依赖糖酵解，常过表达葡萄糖转运体（GLUTs），使碳水化合物功能化纳米颗粒适合研究参数依赖的细胞相互作用。果糖纳米颗粒已被证明可增强MDA-MB-231和MCF-7等乳腺癌细胞系的细胞摄取，其摄取受纳米颗粒尺寸、形态、刚度、载药和糖聚合物结构影响。Stenzel及其同事发现，较小的无定形PMMA-b-PFr纳米纤维（400 nm）在2D和3D乳腺癌细胞模型中比较长纳米纤维（800和2000 nm）细胞摄取增强；后续研究显示PMMA-b-PFr相比聚（丙烯酸正丁酯）-b-PFr核刚度增加，导致更高细胞摄取和更深组织穿透。尽管如此，制备具有精确尺寸、形态和分散性控制的糖聚合物纳米颗粒仍具挑战。结晶糖聚合物基BCP通过活体CDSA可克服这些挑战，获得刚性核和各向异性纳米颗粒及精确尺寸/分散控制。Stenzel及其同事报道PCL-b-PFr可通过活体CDSA产生尺寸控制2D血小板，并证明巨噬细胞经完全溶酶体降解后发生尺寸无关内化，但其在乳腺癌细胞中的摄取尚未研究。受此启发，研究人员假设具有PFr冠的结晶1D纳米纤维具有有利生物性质，因为较小横截面积促进跨细胞膜，并可能在未来体内研究中延长血管循环。此外，虽然无定形核聚果糖纳米颗粒作为乳腺癌药物递送载体的潜力已被证明，但结晶聚果糖纳米颗粒此前未被研究。因此，研究人员制备长度控制、低分散PFTMC₂₆-b-PFr₁₀₇纳米纤维，通过种子生长活体CDSA；选择PFTMC因其生物相容和可生物降解结晶核形成嵌段，可稳健CDSA并可靠产生具有广泛冠化学的1D纳米纤维。研究人员检查其作为乳腺癌细胞药物递送载体的潜力，将PTX负载到不同尺寸和形状纳米颗粒，并测定对MDA-MB-231乳腺癌细胞的效力。此外，研究人员将PFTMC-b-PFr和PFTMC-b-PDMAEMA结合在单一纳米纤维中，以调节冠组成和表面电荷。顺序活体CDSA产生具有空间限定和序列控制PFr或PDMAEMA段的三嵌段纳米纤维，并掺入荧光单体用于可视化生物相互作用。总体而言，该工作描述了长度和序列控制的糖聚合物纳米纤维，具有可调表面化学、电荷和细胞毒性，作为设计聚合物纳米药物的平台。

关键技术方法：研究采用开环聚合（ring opening polymerization，ROP）和可逆加成-断裂链转移（reversible addition–fragmentation chain-transfer，RAFT）聚合制备PFTMC-b-PFr BCP，并脱保护PFr冠。通过均相成核在DMF:MeOH或DMSO:MeOH中自组装，超声破碎获得种子；以种子生长活体CDSA，通过单聚体/种子质量比控制纳米纤维长度。透析转水后，用透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、凝胶渗透色谱（GPC）、¹H核磁共振（NMR）和ζ电位表征。采用溶剂蒸发法将PTX负载到无定形纳米球和结晶种子，最大载药量30 wt%。用CellTiter Glo 2.0检测MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞活力，用流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）研究细胞摄取和溶酶体共定位。顺序活体CDSA制备含BODIPY染料标记单聚体的荧光三嵌段纳米纤维。样本细胞为MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞系。

研究结果：

Synthesis of PFTMC₂₆-b-PFr_n：研究人员通过ROP和RAFT聚合结合制备PFTMC_n-b-PFr_m，随后脱保护聚果糖冠。PFTMC大分子链转移剂（PFTMC-CTA）经FTMC单体ROP获得，¹H NMR显示聚合度DP_n为26，GPC显示低分散性?_M=1.21，M_n=4500 g mol^?1。使用保护果糖单体进行RAFT聚合，得到PFTMC₂₆-b-PPFr_n，冠形成嵌段聚合度为66和107，M_n=22300和31900 g mol^?1。GPC确认BCP形成，?_M=1.24和1.31。TFA:H₂O脱保护后，¹H NMR显示异丙叉信号消失。结论成功合成PFTMC₂₆-b-PFr_66/107。

Living CDSA of PFTMC-b-PFr：通过DMF或DMSO与MeOH混合溶剂均相成核研究PFTMC₂₆-b-PFr₁₀₇自组装。TEM显示形成形态纯但多分散1D纳米纤维；DMSO促进聚集，DMF:MeOH 4:6最小聚集，选为自组装溶剂。超声3 h 0°C得到种子，L_n=46 nm，?_L=1.15。种子生长加入unimer，m_unimer/m_seed决定长度。得到181 nm至1146 nm纳米纤维，分散性<1.07，长度与m_unimer/m_seed线性关系R²=0.9855，确认活体CDSA行为。结论获得低分散、长度控制的糖聚合物冠纳米纤维。

Aqueous stability and cytotoxicity studies：制备PFTMC₂₆-b-PFr₁₀₇纳米纤维L_n=142 nm，?_L=1.04，透析转水后TEM显示L_n=155 nm，?_L=1.05，DLS显示R_h增加约ΔR_h=19 nm。水中储存4个月R_h无变化，ζ电位在NaCl和HEPES中分别为?22和?25 mV。MDA-MB-231和MCF-7细胞与1–100 μg mL^?1纳米纤维孵育24 h，无可见细胞毒性。纳米球d_core=12 nm，?_diameter=1.06，R_h=33 nm，?27 mV，也无毒性；短种子L_n=43 nm，?_L=1.19和长纳米纤维L_n=657 nm，?_L=1.02在MDA-MB-231中至100 μg mL^?1无毒性。结论：不同尺寸和形状PFTMC₂₆-b-PFr₁₀₇纳米颗粒在24 h内无急性毒性，具药物递送潜力。

Loading of PTX onto amorphous nanospheres and crystalline seeds：研究人员通过溶剂蒸发法将PTX非共价负载到预形成纳米颗粒的结晶核/核-冠界面。将PTX的EtOH溶液加入纳米颗粒水溶液，蒸发EtOH。DLS监测显示游离PTX在10 wt%当量时形成R_h=1071 nm聚集体。10、20、30 wt%载药时，纳米球R_h为35、25、28 nm，种子为38、41、38 nm，接近未载药纳米颗粒；40 wt%时出现第二粒径分布（75 nm和85 nm）且分布变宽，表明PTX开始卸载。TEM确认20–30 wt%仅见纳米球，60和100 wt%见游离药物黑色聚集体。结论：无定形纳米球和结晶种子最大载药量为30 wt%，预形成纳米球保持形状和尺寸。

Delivery of PTX to MDA-MB-231 cells in a 2D cell model：制备10–40 wt% PTX负载种子，与MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞孵育72 h。从0.5 μg mL^?1载药种子开始细胞活力下降，最低约30%，与PTX载量无关。IC₅₀随载药至30 wt%降低，30 wt%最低为0.038 μg mL^?1；40 wt%为0.042 μg mL^?1，无统计学显著性。比较纳米球、种子、155 nm和657 nm纳米纤维载30 wt% PTX，72 h后0.5–10 μg mL^?1细胞活力降至45–34%。仅种子纳米纤维与其他纳米颗粒和游离药物有统计学显著差异。游离PTX IC₅₀=0.090 μg mL^?1，种子最低0.038 μg mL^?1。结论：所有载药PFTMC₂₆-b-PFr₁₀₇纳米颗粒对乳腺癌细胞有抗癌活性，短结晶核种子优于其他。

Preparation of fluorescent triblock nanofibers：通过顺序活体CDSA在纳米纤维上安装离散段，实现空间和序列控制，调节表面化学、电荷并引入荧光标签。制备G-PFTMC₂₆-b-PFr₆₆，将羧酸功能化BODIPY-FL_502/511缩合到PFr冠或链端；荧光光谱显示515 nm发射。另用R-PFTMC₁₆-b-PDMAEMA₁₁₂含BODIPY_630/650-X。使用非荧光种子PFTMC₂₆-b-PFr₁₀₇（F，L_n=51 nm，?_L=1.10）或PFTMC₂₀-b-PDMAEMA₃₀₀（D，L_n=32 nm，?_L=1.26），与染料标记unimer GF或RD组合，得到GF-F-GF、GF-D-GF、RD-D-RD、RD-F-RD四种三嵌段纳米纤维。TEM显示长度分别为125、114、115、101 nm，?_L为1.11、1.06、1.04、1.05；染色显示分段结构。转水后长度/分散变化小；GF-F-GF紧密缔合，GF-D-GF和RD-F-RD在水中因氢键和静电聚集，但RD-F-RD加热37°C时R_h从388降至69 nm，PBS 37°C R_h=59 nm。结论成功制备四种荧光三嵌段纳米纤维。

Cellular uptake studies of triblock nanofibers with breast cancer cells：荧光三嵌段纳米纤维50 μg mL^?1与MDA-MB-231孵育4 h，流式细胞术分析。G荧光太弱未进一步研究。RD-D-RD的MFI=609000，高于RD-F-RD的MFI=193157。仅含正电PDMAEMA冠段的三嵌段纳米纤维细胞摄取优于含阴离子PFr中心段者。CLSM与LysoTracker Blue共定位显示，RD-D-RD低溶酶体蓄积（Pearson r=0.229），RD-F-RD中等溶酶体蓄积（r=0.429）。Z-stack显示荧光遍布细胞。细胞毒性：RD-D-RD IC₅₀=12 μg mL^?1，RD-F-RD显示最小细胞毒性（>79%细胞活力）。结论：中心PFr段降低急性细胞毒性，促进乳腺癌细胞摄取并伴中等溶酶体蓄积。

讨论与结论总结：讨论强调阳离子PFTMC-b-PDMAEMA纳米纤维虽摄取优越，但存在细胞毒性，形成效力与毒性权衡；中性/阴离子PFr纳米纤维无急性毒性但细胞相互作用有限。三嵌段设计将PFr和PDMAEMA结合，可在单一纳米纤维中调节表面电荷、序列和功能。短结晶种子在PTX递送中优于无定形纳米球和其他纳米纤维，表明结晶核和刚度影响药物活性。三嵌段中中心PFr段减少表面PDMAEMA比例，降低急性毒性，同时保留细胞摄取和中等溶酶体蓄积；仅PDMAEMA冠层摄取最高且溶酶体逃逸，但毒性较高。该工作说明活体CDSA的精确尺寸、序列和表面化学控制可用于系统调节纳米颗粒生物性能。

结论翻译：总之，研究人员制备了一系列新的糖聚合物基两亲性嵌段共聚物PFTMC-b-PFr。PFTMC₂₆-b-PFr₁₀₇经活体CDSA产生长度控制、低分散纳米纤维，在水中具有优异胶体稳定性达4个月。这使研究人员能够测试不同尺寸和形状纳米颗粒对MDA-MB-231和MCF-7两种乳腺癌细胞系的体外急性细胞毒性，所有测试纳米颗粒无论尺寸和形状均未观察到毒性。不同长度纳米纤维及纳米球负载30 wt%紫杉醇，并研究其向乳腺癌细胞的递送，种子纳米纤维显示最低IC₅₀值0.038 μg mL^?1，优于游离药物和其他测试纳米颗粒。通过顺序活体CDSA构建具有明确PFTMC-b-PFr和PFTMC-b-PDMAEMA段的荧光分段三嵌段纳米纤维，得到四种三嵌段纳米纤维，长度101至125 nm，低分散性1.05至1.11。流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜显示，具有末端和中心PDMAEMA段的RD-D-RD在乳腺癌细胞中显示优越细胞摄取和低溶酶体蓄积，但存在细胞毒性；具有中心PFr段的RD-F-RD发生细胞摄取，具中等溶酶体定位和最小细胞毒性。本工作强调，活体CDSA赋予的精确控制使研究人员能够研究纳米颗粒形状、尺寸和均匀性对生物性能的影响，并通过空间和序列控制定制其功能，以设计有前景的下一代药物递送载体。