微流控立体合成空间分辨固定相实现可定量调控的色谱分离选择性

《Chemical Science》：Stereosynthesis of stationary phase with precision defined separation selectivityOpen Access

化学分离基于分子与固定相（stationary phase）和流动相（mobile phase）的差异化相互作用。为实现高效的热力学（thermodynamics）和分子动力学（molecular kinetics），具有键合化学的微米（μm）级球体已成为固定相材料的一般选择。半个世纪以来，在色谱材料制造中，将固定相化学施加到微球上一直是随机、无序和批量过程。这种非立体分辨的合成策略导致多个官能团共定位于相同空间，包括被设计为具有不同或相反选择性的官能团，如疏水和亲水、阳离子交换和阴离子交换等。这些功能配体的共定位可引起彼此严重干扰，导致偏离设计分离选择性，甚至对其产生不利影响。这种非空间分辨的固定相化学削弱了混合模式分离（mixed-mode separation）的有效性，并在追求高分离性能时限制了多功能组装的可行性和自由度。在本研究中，通过微流控精密制造，立体合成了具有明确功能域的微球固定相，并实现了可定量调节的化学选择性（chemical selectivity）。以经典混合模式固定相为基准，发现原本存在但受严重约束的色谱保留能力可通过化学功能的空间分辨排列而被释放。当前研究表明，作为一个尚未探索的结构参数，固定相化学的空间分布是一种独立特征，可实现热力学的精准设计和自由调节，为高性能色谱（high-performance chromatography）提供新途径。

一、研究背景与问题

高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）是强大且广泛使用的现代分离技术，一直寻求具有可控保留行为和高分离选择性的材料，用于分子混合物分离。固定相与流动相之间的热力学特征决定溶质分子在两者间的平衡过程，是有效分离度的决定因素。尽管已有大量固定相材料被开发和商业化，但面对涉及多重相互作用的新兴分离挑战，仍需要广泛而多样的选择性。通过组合多种选择性机制，如疏水、亲水、离子交换等，所谓混合模式固定相（mixed-mode stationary phase）已展示独特选择性，并能够分离基于单一相互作用难以分离的分子。

目前，混合模式分离材料通常通过批量处理策略制备，即多个带有不同功能的配体随机键合到微球表面，缺乏对其数量或空间分布的精确控制。从分子相互作用角度看，这种不受控且不明确的多功能组合可能导致非理想竞争或预期相互作用的相互屏蔽，从而影响可实现的选择性。结果是，即使固定相化学组成相同，当功能团以不同空间分布施加时，有效选择性也可能不同。然而，由于缺乏可在立方微米尺度精确控制域化学的合成方法，固定相化学在微米尺度上的空间分布长期被忽视和未探索。自键合相色谱出现以来，固定相化学的空间分布很少被视为独立考虑因素，导致分析物分子经历不可控且不可预测的有效分离选择性，分离性能因而被动、经验化，而非理性、可预测。因此，研究人员需要将官能团的定量和定位作为必要维度，通过自上而下设计和立体合成策略来空间解析固定相架构。

二、研究开展、结论与意义

在本工作中，研究人员提出基于微米尺度立体合成的精准定义固定相。不同化学基团以Janus结构引入微球不同区域，在单一微米级球体内实现功能的独立和定量控制。该立体合成策略能够制备适用于HPLC的单分散微球，并兼容多种单体，覆盖疏水、亲水、阳离子交换、阴离子交换等多种固定相化学。空间分辨固定相能够准确调节化学选择性，并作为理解功能团空间分布对色谱性能影响的模型材料，为多相互作用色谱的理性设计和具有预定选择性的固定相精密制造提供了新视角和方法。

三、主要关键技术方法

研究人员以微流控平台为核心，使用四条相同通道高通量生成Janus结构单分散液滴作为模板；连续相为氟化油，亲水分散相A和疏水分散相B分别使用互不相溶的H₂O和二甲基碳酸酯（DMC），并溶解丙烯酸酯单体和光引发剂，经紫外（UV）照射固化并收集微球。通过调节微流控通道尺寸控制粒径，通过调节两分散相流速控制半球比例。研究采用光学显微镜、荧光显微镜、扫描电子显微镜（SEM）、激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）、共聚焦拉曼、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）以及色谱柱装填和色谱评价。原文不涉及样本队列来源；研究对象为人工合成的固定相微球。

四、研究结果

固定相微球的立体合成（Stereosynthesis of stationary phase microspheres）

研究人员通过微流控平台制备空间分辨固定相。以Janus结构单分散液滴为模板，合成粒径分布窄且半球分辨明确的微球。微球尺寸可在3.9至19.4 μm范围内制备，其中10 μm微球用于后续色谱研究。所得液滴和微球具有良好单分散性，变异系数（CV）≤6.2%；四通道收集的微球均一性CV=2.4–6.2%，每芯片高通量达4000 Hz，1小时内生成的微球可支持制造四根HPLC柱（150 μm i.d. × 100 mm length）。结论是，微流控立体合成可在不破坏半球结构的情况下自由调节粒径，并获得适用于HPLC的单分散Janus微球。

固定相化学的精准组装（Precision assembly of stationary phase chemistry）

利用互不相溶的合成体系，研究人员将多种单体分别注入两分散相，实现功能团在Janus微球上的多样组装，覆盖反相色谱（reversed-phase chromatography, RPC）、亲水相互作用色谱（hydrophilic interaction chromatography, HILIC）和离子交换色谱（ion-exchange chromatography, IEC）等色谱模式。可引入烷基、苯基、酰胺、羟基、羧基、铵等功能团；环氧基可引入亲脂相，并通过十二胺开环引入十二烷基。通过调节两分散相流速，可实现半球比例从1:5至5:1的定量组装，文中展示1:2至2:1。光学显微镜、SEM、LSCM和共聚焦拉曼扫描证明Janus结构、单分散性、球形度及功能团空间分辨分布。结论是，固定相化学可被空间分辨且定量地组装。

分离选择性的调节（Tuning of separation selectivity）

研究人员将不同半球比例微球装填为色谱柱进行评价。Janus微球在随机装填和分离过程中可耐受高达40 MPa压力。以酰胺（HILIC型配体）和C₁₂（RPC配体）定量组合的空间分辨固定相为例，在HILIC模式下，细胞色素C的亲水保留随酰胺相含量从0–100%增加而持续增加；在RPC模式下，以甲苯为代表的疏水分析物随C₁₂相含量增加呈现相反趋势。多种分析物的保留因子（k）与半球比例呈线性关系，表明保留能力可精准响应所施加的固定相化学域。选择性因子（α）可通过保留因子随固定相比例变化的斜率进行调节，最高可达8，且α范围可达?9至8，实现完全的选择性反转，即洗脱顺序反转。结论是，固定相空间分布作为未探索的结构参数，可作为独立特征用于调节色谱热力学。

固定相的理性设计（Rational design of the stationary phase）

在传统固定相中，功能团随机共定位于同一空间，导致相互作用位点无序分布，并不可避免地产生空间效应、静电排斥或其他干扰，使保留行为和选择性不可预测。立体合成固定相则使不同功能团在空间和化学上解耦，使一个功能团能够独立与分析物分子相互作用，而不受第二个功能团的化学干扰。研究人员以RPC-HILIC为模型，制备空间分辨和非空间分辨固定相，二者均由酰胺相和C₁₂相以1:1（v/v）组成。低乙腈（ACN）比例条件下，疏水探针甲苯在两种微球上均表现RPC保留，但空间分辨微球保留增强152%；高ACN比例条件下，亲水探针尿嘧啶在两种固定相上均表现HILIC保留，但空间分辨固定相亲水保留增强213%。化学上，两者施加的疏水和亲水基团量相同，表明空间精确施加释放了原本存在于非空间分辨混合模式固定相中、但因功能团随机共定位而被大幅削弱的保留能力。按色谱理论，RPC和HILIC中分配过程主导分子保留，固定相表面形成溶剂化层，分子在溶剂化层和流动相之间分配；共定位酰胺和C₁₂会打断表面亲水性和疏水性，削弱稳定溶剂化层形成，而空间分辨分布有利于有效形成溶剂化层，从而同时增强RPC和HILIC保留。非空间分辨微球上探针分子峰拖尾更明显，萘的不对称因子A_s=4.57，胞嘧啶A_s=5.03；空间分辨微球上A_s分别为1.54和1.28。离子交换混合模式中，空间分辨微球将阴离子交换基团三甲铵和阳离子交换基团C₁₁羧酸分别分布于两半球，非空间分辨固定相则随机共定位。空间分辨微球上，log k与log C呈线性关系，符合离子交换保留特征。阴离子分子苯甲酸和腺苷5^′-单磷酸（AMP）在空间分辨固定相上保留显著更高，而非空间分辨固定相保留可忽略；空间分辨固定相上还观察到两种阴离子的洗脱顺序反转，而阳离子保留在两相间几乎无差异。结果解释为，在非空间分辨微球中，短链阴离子交换基团受到空间效应和外层长链阳离子交换配体C₁₁羧酸的静电排斥阻碍；空间分辨固定相中，未被屏蔽的短链阴离子交换基团有效保留阴离子，AMP因在pH 7下带更多负电荷而保留更高。动力学方面，10 μm空间分辨和非空间分辨固定相在RPC-HILIC和IEC模式中，使用一系列探针分子观察到约1000–8000 plates per m的相似效率。结论是，设计多相互作用固定相时，除配体种类、组成和丰度外，还应考虑功能团空间分布；当固定相同时含亲水和疏水基团、相反电荷物种或具空间位阻的配体时，随机分布可能引入局部干扰，使保留行为复杂化，并几乎无法获得设计的分离选择性。

五、讨论与结论

讨论部分表明，固定相化学的空间分布可作为独立色谱特征。传统随机共定位会造成官能团间干扰，使保留和选择性不可预测；空间分辨排列通过隔离相互作用位点减少化学干扰，改善峰形，增强保留能力，并支持灵活的功能组装和预定义化学选择性。立体合成为分离材料的理性设计和精密制造提供了新方法，推动面向性能设计（performance-by-design）的发展。

研究结论翻译：总之，作为一个尚未探索的结构参数，固定相化学的空间分布已被引入为一种独立色谱特征，其在调控分离热力学中的作用已被证明是可设计且可调节的。为达到这一理解并展示制造能力，研究人员开发了微米尺度立体合成，以隔离相邻相互作用位点并减少经典分离材料中存在的化学干扰。由此合成的空间分辨固定相呈现出改善的峰形、增强的保留能力以及灵活的功能组装，支持预定义化学选择性。更重要的是，立体合成为分离材料的理性设计和精密制造提供了新方法，为面向性能设计铺平道路。