以橙汁为底物发酵牛奶开菲尔粒与水开菲尔粒：新型类开菲尔饮料的制备与表征

《Foods》：Orange Juice as a Substrate for Milk and Water Kefir Grains: Production and Characterization of Novel Kefir-like Beverages

　　

以橙汁为底物，使用牛奶开菲尔粒（MKG）和水开菲尔粒（WKG）制备新型类开菲尔饮料。研究人员监测了48 h发酵过程中理化参数、底物消耗、代谢产物生成、微生物种群、抗菌活性、维生素与矿物质组成以及挥发性化合物的变化。两种开菲尔粒均支持乳酸菌（LAB）、醋酸菌（AAB）和酵母菌的生长，最终种群分别达到约6–7、5–6和8 log CFU/mL。WKG促进了乳酸更早期的生成，并持续产生更高水平的乙酸、乙醇和抗菌活性，而MKG在48 h后产生的乳酸浓度略高，并与钾、磷、镁和钙的更大增幅相关。维生素B1、B2和C在MKG和WKG发酵过程中均下降。发酵显著改变了挥发性化合物谱，潜在香气贡献从以香脂和柑橘香调为主转向果香和甜香特征，尤其在48 h后。总体而言，开菲尔粒类型和发酵时间强烈影响发酵橙汁的理化、微生物、营养、抗菌和挥发性特征。这些发现证明了两种开菲尔粒在开发非乳制品类开菲尔饮料方面的潜力。

论文解读

一、研究背景与问题

开菲尔（Kefir）是一种传统发酵饮料，由开菲尔粒中的乳酸菌（LAB）、醋酸菌（AAB）和酵母菌组成的复杂共生菌群接种于牛奶中发酵而成。发酵过程中，这些微生物将碳水化合物转化为有机酸、乙醇、二氧化碳、甘油、维生素、胞外多糖及多种生物活性代谢物，赋予开菲尔营养、感官和功能特性。近年来，消费者对植物基和无乳糖功能食品的需求日益增长，推动了以果汁、蔬菜、谷物等富含糖类底物制备非乳制品类开菲尔饮料的研究。果汁因天然含有可发酵糖、有机酸、维生素、矿物质和植物化学物质而成为极具吸引力的发酵底物。其中，橙汁是全球消费最广泛的果汁之一，富含维生素C、叶酸、类胡萝卜素、类黄酮、钾等微量营养素。

然而，现有研究主要聚焦于微生物存活率、理化特性、抗氧化活性、酚类化合物和挥发性谱，关于开菲尔发酵对维生素组成（尤其是B族维生素、维生素C和维生素D的同步变化）以及矿物质组成的影响信息十分有限。此外，在相同条件下比较牛奶开菲尔粒和水开菲尔粒发酵橙汁动态的研究仍然缺乏。因此，本研究旨在系统比较两种开菲尔粒发酵橙汁的差异，为优化水果基开菲尔发酵和开发非乳制品发酵饮料提供依据。

二、研究内容与结论

研究人员以新鲜非浓缩复原橙汁为底物，分别使用牛奶开菲尔粒（MKG）和水开菲尔粒（WKG）在20 ± 1 °C下进行48 h发酵，系统评估了发酵过程中pH、糖类、蛋白质、有机酸、乙醇、甘油、游离生物量及抗菌活性的时间变化，乳酸菌、醋酸菌、酵母菌、假单胞菌属（Pseudomonas spp.）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的种群动态，维生素和矿物质组成变化，以及挥发性化合物的改变。研究发现，两种开菲尔粒均能有效发酵橙汁，但产生了代谢特征截然不同的饮料。MKG发酵表现为初始乳酸生成较慢但48 h后最终浓度略高，而WKG发酵则促进更早的乳酸生成以及更高的乙酸、乙醇产量和抗菌活性。发酵后饮料中乳酸菌种群达到约10⁶–10⁷ CFU/mL，酵母菌达到约10⁸ CFU/mL。维生素B1、B2和C在两种发酵中均下降，但WKG发酵48 h后烟酸（维生素B3）浓度超过初始水平。矿物质方面，MKG发酵与钾、磷、镁和钙的更大增幅相关，钙浓度从63.66 mg/kg升至97.15 mg/kg。挥发性谱发生显著改变，特征性柑橘萜烯和醛类大幅减少，醇类、酯类和含氧萜类积累，香气贡献从香脂和柑橘香调转向果香和甜香特征。这些发现证明了两种开菲尔粒在开发非乳制品类开菲尔饮料方面的潜力，并强调了开菲尔粒类型和发酵时间对产品特性的决定性影响。

三、主要关键技术方法

本研究采用的关键技术方法包括：选择性培养基平板计数法用于乳酸菌、醋酸菌、酵母菌、肠杆菌科和假单胞菌属的活菌计数；高效液相色谱（HPLC）系统配备ION-300有机酸柱用于糖类、有机酸和醇类的定量分析；Lowry法测定蛋白质浓度；微波消解结合电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）测定矿物质组成；高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）同时定量维生素B1、B2、B3、三种维生素B6 vitamers和维生素C；气相色谱-质谱联用（GC-MS）结合内标法分析挥发性有机化合物（VOCs），并通过气味活性值（OAV）评估各化合物对香气的潜在贡献；基于光度法的总抗菌活性（TAA）生物测定，以Carnobacterium piscicola CECT 4020为指示菌株，采用半数抑制剂量（ID₅₀）模型计算抗菌活性单位。开菲尔粒购自西班牙Kefiralia公司，橙汁为西班牙Mercadona超市现榨非浓缩橙汁。

四、研究结果

3.1 橙汁与牛奶和水开菲尔粒的发酵动态

两种发酵系统中，pH在前32 h变化轻微，仅在发酵末期显著下降（MKG降至3.36，WKG降至3.97）。乳酸和乙酸是形成的主要有机酸。WKG在24 h时乳酸浓度显著高于MKG，而48 h后MKG略高。WKG的乙酸浓度在24 h和48 h均显著高于MKG，48 h时分别达到9.64 g/L和8.74 g/L。柠檬酸和苹果酸总体下降，琥珀酸略有增加。糖代谢方面，蔗糖迅速水解为葡萄糖和果糖，MKG对两种单糖利用相对均衡，而WKG优先消耗葡萄糖导致果糖短暂积累。乙醇生成在WKG发酵中更为显著，48 h时达到10.84 g/L（1.37% v/v），超过欧盟1.2%酒精强度申报阈值。游离生物量在两种系统中均增加，WKG发酵中开菲尔粒增重更大。蛋白质浓度在两种发酵中均从6.00 g/L降至约2–2.5 g/L。总抗菌活性在两种系统中均增加，WKG值更高。

3.2 发酵过程中活菌LAB、AAB和酵母菌的种群动态

两种发酵中，所有微生物群在前16 h迅速增殖后进入稳定期。MKG发酵中LAB最终达到6.27 log CFU/mL，AAB稳定在5.77–6.02 log CFU/mL，酵母菌为主要菌群达8.02 log CFU/mL。WKG发酵中LAB达6.53 log CFU/mL，AAB稳定在5.47–5.72 log CFU/mL，酵母菌约7.98 log CFU/mL。假单胞菌属和肠杆菌科在所有样品中均低于30 CFU/mL。

3.3 发酵过程中维生素组成的变化

维生素B1在两种发酵中均大幅下降，MKG发酵48 h后从51.55 μg/L降至2.48 μg/L。维生素B2从22.40 μg/L降至MKG 12.63 μg/L和WKG 5.81 μg/L。维生素B3呈现对比模式：MKG发酵中下降后略有回升但低于初始值，而WKG发酵48 h后升至62.89 μg/L超过初始水平。三种维生素B6 vitamers响应各异，吡哆醛在WKG中降幅更大，吡哆醇在MKG中24 h短暂积累后下降，吡哆胺在MKG中大幅下降而WKG中48 h后回升。维生素C降幅最大，MKG发酵48 h后降至74.25 mg/L，WKG发酵后仅剩1.61 mg/L。

3.4 发酵过程中矿物质组成的变化

钾在MKG发酵中从1590.96 mg/kg升至1772.12 mg/kg，WKG中变化较小。磷在两种发酵中均增加，MKG增幅更大。镁在MKG中从113.93升至126.89 mg/kg，WKG中基本稳定。钙在MKG中从63.66升至97.15 mg/kg，增幅最大，WKG中几乎不变。钠在MKG中升至约22 mg/kg，WKG中24 h升至52.71 mg/kg后48 h降至28.70 mg/kg。铁和锌总体下降，铜在MKG中略增而WKG中下降，硒波动较小。

3.5 橙汁开菲尔发酵过程中挥发性组成的改变

共鉴定出38种挥发性化合物，分属醇、醛、有机酸、酯、酮和萜类。未发酵橙汁中萜类占主导，D-柠檬烯为主要化合物（136.89 mg/L）。发酵大幅重塑该谱：D-柠檬烯在MKG 48 h后降至23.31 mg/L，WKG中降至43.05 mg/L。醇类绝对浓度增幅最大，从42.70 mg/L升至约62–65 mg/L。酯类相对增幅最大，从0.87 mg/L升至14.44 mg/L（MKG 48 h），丁酸乙酯为主要发酵衍生酯。醛类大幅下降，癸醛、十二醛、橙花醛和香叶醛几乎完全消耗。挥发性有机酸仅在MKG样品中检出，辛酸、正癸酸和十二酸逐渐积累。酮类适度增加，3-辛酮从无到有稳定积累。香气贡献从香脂和柑橘香调转向果香和甜香，48 h后果香/甜香类别占总OAV的52%–58.6%。

五、讨论与结论

讨论部分指出，发酵过程中pH变化受多种有机酸及其盐缓冲能力的影响，强酸（柠檬酸、苹果酸）被消耗而弱酸（乳酸、乙酸）积累，导致pH在16–32 h间暂时回升。WKG发酵中乙醇的大量生成反映了其酵母群落对酸性底物（橙汁pH 3.97）的更好适应。48 h后乙酸的急剧增加提示醋酸菌氧化酵母衍生乙醇的作用。高浓度乙酸可能赋予明显酸味和刺激性，影响消费者接受度，建议采用较短发酵时间（如24 h）。乙醇含量超过0.5% v/v可能限制产品对儿童、孕妇及因健康、宗教或个人原因避免酒精的消费者的适用性。维生素变化可能反映微生物的利用、合成和转化，但未设置时间匹配的未接种对照，不能完全归因于开菲尔微生物活动。矿物质增加可能来自开菲尔粒释放（包括活化培养基残留成分）和微生物细胞裂解，减少则与微生物同化一致。研究结论为：两种开菲尔粒均能有效发酵橙汁，但产生具有不同代谢特征的饮料；开菲尔粒类型和发酵时间强烈影响发酵橙汁的理化、微生物、营养、抗菌和挥发性特征；这些发现证明了两种开菲尔粒在开发非乳制品类开菲尔饮料方面的潜力。研究局限性包括：每种开菲尔粒仅进行一次发酵运行、未进行感官评价、未鉴定物种/菌株水平微生物、未评估益生菌特性、未进行食品安全挑战试验，批次间重现性需在后续研究中确认。