《International Journal of Molecular Sciences》：Parameter-Based Prioritization of Time-Resolved LC–HRMS Ion Tracks for Untargeted Reaction Monitoring
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本文介绍了一种自动化的、基于参数的工作流程，用于处理时间分辨高分辨率质谱（HRMS）数据。研究人员以ABTS•+自由基阳离子与多酚类抗氧化剂柚皮素之间的反应为例，验证了该方法的实用性。数据采集采用负离子模式下高分辨率质谱（HRMS）与高效液相色谱（HPLC）联
本文介绍了一种自动化的、基于参数的工作流程，用于处理时间分辨高分辨率质谱（HRMS）数据。研究人员以ABTS•+自由基阳离子与多酚类抗氧化剂柚皮素之间的反应为例，验证了该方法的实用性。数据采集采用负离子模式下高分辨率质谱（HRMS）与高效液相色谱（HPLC）联用技术。该算法通过比较连续的时间分辨HRMS测量结果，生成动力学曲线并为每个检测到的物种计算参数。基于这些曲线和参数，研究人员可以初步将每个物种分类为反应物、中间体或产物。该算法已实现为基于Java的软件。由此，每个实验序列中约130万个m/z-强度对的大型数据阵列得以自动处理。该工作流程在每个重复序列中生成了可管理的候选集。采用5 ppm质量容差进行跨重复匹配，在三次反应运行中一致检测到29条离子轨迹，用于后续分析。这些离子可随后通过人工检查以鉴定化合物结构。总体而言，该方法为非靶向反应监测提供了一种筛选工具，并支持复杂化学体系中后续的结构注释。
基于参数优先级排序的时间分辨LC–HRMS离子轨迹分析：面向非靶向反应监测的新型数据处理工作流
一、研究背景与问题提出
在复杂化学体系研究中，追踪多组分体系内化学组成的动态变化是分析化学领域的一项核心挑战。代谢组学、药物稳定性研究等跨学科领域的研究人员经常需要捕捉此类变化。高分辨率质谱（HRMS）凭借其对可检测离子信号的广泛覆盖，成为完成这一任务的理想工具。然而，传统的数据挖掘方式存在显著局限：研究人员通常仅关注起始化合物、预测可能的中间体和产物，在HRMS数据中定位这些已知物种并追踪其浓度变化趋势，而忽略了绝大多数其他离子信号。这种常规的人工峰追踪方法虽然被广泛应用于HRMS与色谱分离联用的分析中，但其仅能捕获分离良好且高强度的信号，且可靠性高度依赖研究者的专业经验。面对数据的庞大规模和复杂性，遗漏风险显著，亟需更高效的数据处理策略。更为全面的替代方案是非靶向监测，但这需要耗费大量精力的处理和专门的计算工作流，以将复杂的LC–MS数据集缩减为可管理的特征集供后续解读。
现有的计算平台，如XCMS、MZmine、MS-DIAL和Compound Discoverer，虽在数据预处理、对齐和差异比较方面不可或缺，但均缺乏针对连续时间序列测量中特征行为进行自动化和可解释性优先级排序的功能。时间序列非靶向数据集的分析面临额外挑战，因为连续时间点之间的关系可能无法被常规模式识别方法充分表征。因此，需要一种能够根据离子轨迹在有序测量序列中的行为对其进行快速优先级排序的新方法。
二、研究内容与核心结论
针对上述需求，研究人员开发了一种基于参数的工作流程，用于处理时间分辨HPLC–ESI–HRMS数据集，并对表现出潜在相关时间行为的离子轨迹进行优先级排序。该工作流以ABTS•+自由基阳离子被柚皮素抑制的反应作为概念验证。研究的主要目标是将完整数据集缩减为数量可控的候选离子，以供后续结构和机理研究。
研究得出以下核心结论：该算法能够将每个实验序列中约130万个m/z-强度对的大型数据阵列自动处理为约12.6万条离子轨迹，并通过数据漏斗的多级参数筛选，最终在第一重复序列中选出53条轨迹。经跨重复匹配（5 ppm质量容差），最终在三次重复实验中一致检测到29条可复现的离子轨迹。这些轨迹根据其时间行为模式可分为下降型、上升型和钟形三类，分别对应反应物、产物和中间体的典型动力学特征。代表性离子的初步结构注释表明，该工作流能够保留与反应中化学转化相关的离子，包括去质子化的柚皮素离子（m/z 271.0605）、B环邻苯二酚氧化衍生物（m/z 287.0563）、相应的B环邻醌（m/z 285.0406）及其水合物（m/z 303.0509），以及过硫酸根离子（m/z 112.9553）和半ABTS部分（m/z 257.0057）等。敏感性分析表明，在测试范围内，主要化学可解释特征的保留并不强烈依赖于单一精确阈值。
三、关键技术方法
研究人员为开展本研究，主要采用了以下几项关键技术方法：首先，开发了基于Java的软件应用程序（JDK 22，IntelliJ IDEA开发，Swing和JFreeChart构建图形界面），用于处理时间分辨HRMS数据。其次，设计了数据排序算法，通过可配置的质量容差（本研究为5 ppm）在序列中匹配唯一m/z值，构建离子轨迹。再次，构建了数据漏斗筛选流程，应用最大强度、分段皮尔逊相关系数（|r|）、MinMax比值和早期变化四个参数对离子轨迹进行分组和优先级排序。最后，采用跨重复匹配策略，仅保留在三次重复实验中均被检测到的离子轨迹。数据采集使用Dionex Ultimate 3000 RSLC液相色谱联用Orbitrap Fusion Lumos高分辨质谱仪，负离子模式电喷雾电离（ESI）源。
四、研究结果
2.1 算法设计与工作流：算法包含两个连续步骤。第一步将原始m/z-强度数据按时间序列排序，分组为离子轨迹。第二步对这些轨迹应用数据漏斗，过滤无关离子，保留最相关的候选离子供进一步分析。
2.2 实现：算法最初以Excel-VBA宏实现，处理10,000个m/z-强度对需超过30分钟。后转为Java实现，离子轨迹构建在测试条件下仅需不到30秒，显著提高了计算效率。处理负离子模式HPLC–ESI–HRMS扫描数据后，数据集从130万个m/z值缩减至12万个唯一m/z值及其对应离子轨迹。
2.3 数据漏斗的开发：研究人员引入了四个参数化过滤器。最大强度分组依据离子在整个序列中观察到的最大强度的数量级进行排序。相关性分析将时间线分割为重叠窗口，使用|r|值对离子进行分组（A组|r|≥0.99，B组0.90≤|r|<0.99，C组0.70≤|r|<0.90，D组|r|<0.70）。MinMax比值量化相对强度变化的实际重要性，比值接近1表示强度变化显著。早期变化参数专门用于捕获前四个时间点内的快速强度变化。应用这些参数后，第一重复序列从约12.6万条轨迹中选出53条，第二和第三重复序列分别选出61条和69条。跨重复匹配后，最终保留29条可复现离子轨迹。
2.4 代表性优先离子的初步注释：优先化信号包括去质子化柚皮素离子（m/z 271.0605）、B环邻苯二酚氧化衍生物（m/z 287.0563）、B环邻醌（m/z 285.0406）及其水合物（m/z 303.0509），以及过硫酸根离子（m/z 112.9553）和半ABTS部分（m/z 257.0057）。这些初步注释证明了基于参数的工作流能够保留与所研究反应中化学相关转化相关的离子。
2.5 过滤阈值的敏感性：研究人员通过变化相关性和MinMax阈值进行敏感性分析。结果表明，增加任一参数的严格程度会逐步降低保留离子轨迹的比例，而更宽松的阈值则导致更广泛的特征保留。所有六个代表性注释反应相关离子轨迹在测试范围内均保持被选中，仅在0.95的最严格相关性截断值下，六个中有四个被保留。这表明主要化学可解释特征的保留在测试范围内并不强烈依赖于单一精确阈值。
2.6 局限性：当前优先级排序步骤仅使用m/z和时间信号强度，不执行色谱峰拾取和保留时间对齐。MS/MS证据、加合物关系和同位素模式未纳入排序标准。阈值是为当前数据集经验性选择的，不应视为普遍验证的截断值。工作流仅在单一ABTS/柚皮素反应、一种HPLC–ESI–HRMS配置和负离子模式下进行了验证。与已建立的色谱峰拾取、PCA或非靶向LC–MS工作流的直接头对头比较未进行。工作流仅部分自动化，原始数据导出和时间顺序组织需手动执行。
五、讨论与结论
讨论部分指出，该工作流并非旨在替代XCMS、MZmine、MS-DIAL或Compound Discoverer等已建立的LC–MS平台，而是解决一个后续且更具体的任务：根据离子轨迹在有序测量序列中的行为对其进行快速优先级排序。该方法与常规LC–MS预处理和特征分析软件互补而非替代。其作为轻量级独立Java应用程序实现，无需R环境、自定义脚本或构建更广泛的代谢组学工作流，强调透明、基于参数的时间分辨数据集缩减。
研究结论指出，该方法通过将大型数据集转化为可管理的候选离子轨迹集，简化了复杂反应混合物的分析，支持非靶向反应监测和候选反应相关物种的发现。未来发展方向包括自动化模式识别、整合额外分析维度（如同位素/加合物关系、保留时间和源内碎片关系识别）、自动化原始数据导入，以及使用独立基准数据集评估在复杂基质和其他分析平台上的适用性。该软件已作为计算机程序在俄罗斯联邦知识产权局注册（证书号2024664394，2024年6月20日颁发）。
