《International Journal of Molecular Sciences》：Artificial Intelligence for Plant Gene Regulatory Networks
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基因调控网络（GRN）是植物生物学家最希望绘制的图谱，其中箭头从转录因子（TF）指向其控制的基因，解释植物如何发育并响应环境。由于即使验证一条箭头也可能耗时数年，而单个植物基因组包含数千万个候选TF–靶标对，这一差距推动了大量GRN推断计算方法的发展。研究人员
基因调控网络（GRN）是植物生物学家最希望绘制的图谱，其中箭头从转录因子（TF）指向其控制的基因，解释植物如何发育并响应环境。由于即使验证一条箭头也可能耗时数年，而单个植物基因组包含数千万个候选TF–靶标对，这一差距推动了大量GRN推断计算方法的发展。研究人员在此综述植物GRN推断的三代计算方法，并以五级证据阶梯衡量这些方法，包括统计关联（statistical association）、条件依赖（conditional dependence）、物理结合（physical binding）、功能调控（functional regulation）和因果回路（causal circuits）。经典统计学和机器学习（ML）将复杂的基因表达数据简化为清晰、优先排序的预测。单细胞（single-cell）和多组学（multi-omics）等技术有助于基于染色质可及性（chromatin accessibility）和结合基序（binding motifs）发现细胞类型特异性网络。目前，深度学习（DL）可以直接从基因组序列中解读顺式调控语法（cis-regulatory grammar），而在植物基因组和数百万细胞上训练的基础模型（foundation models, FMs）具有在不同物种间共享调控见解的令人振奋潜力。最有希望的前进路线是lab-in-the-loop分工，其中基础模型不是作为神谕，而是作为假设引擎，将五千万个候选TF–靶标对压缩为最值得实验台时间的几百条边，每轮验证都会锐化下一轮预测。
1. Introduction
论文指出，基因调控网络（GRN）是植物生物学家解释发育与环境响应的核心对象，转录因子（TF）指向靶基因的箭头承载方向与解释力。实验验证单条边常需多年，植物TF家族冗余使多突变体组装困难，且基因组含数千TF与数万基因，候选TF–靶标对达数百万。表达谱、单细胞图谱、玉米染色质可及性和DAP-seq cistrome等数据增长并未直接给出箭头，故推动计算推断。方法经历三代：经典统计与机器学习（ML）、单细胞与多组学、深度学习（DL）与基础模型（FM）。综述先从头构建GRN，再追踪三代方法并以五级证据评价，旨在使GRN推断对植物生物学家可读，并指出AI FMs有望从关联走向因果。
2. GRN Inference from Scratch
以拟南芥根氮响应为例，RNA-seq发现数千基因变化，需识别调控TF与靶基因。推断从表达矩阵开始，基于guilt by association计算Pearson相关或互信息，保留高统计依赖对形成共表达网络，WGCNA可分组为模块；但共表达对称，不能定向或区分直接与共同上游。GENIE3将推断转为预测，对每个靶基因用随机森林从所有TF表达预测其表达，按TF重要性输出全基因组有向置信网络。随后用结合基序或DAP-seq等实验结合位点过滤，SCENIC和MINI-EX体现此策略。最终网络作为假设生成器，枢纽TF和top边进入实验验证，确认边反馈为下一轮先验。
3. The Claim Behind the Arrow
边至少表示五类命题：第1级统计关联；第2级条件依赖；第3级物理结合，由ChIP-seq、CUT&Tag和DAP-seq测量；第4级功能调控，由敲除或诱导激活测定；第5级为特定细胞状态中定向、背景特异的因果机制。第2级是推断核心，间接边为常见假阳性，偏相关、ARACNe和GENIE3分别处理。表达推断多估计第1–2级，金标准多编码第3级，而生物学家需要第4–5级，下一代方法须桥接关联、结合与因果。
4. Statistical Methods for GRN Inference
第一代方法将经典统计用于bulk表达，至今常用。Pearson相关保留高阈值对，WGCNA将相关基因分组为模块，枢纽基因成为候选调控因子。信息论方法如互信息捕捉非线性；CLR抑制虚假关联；ARACNe剪枝全连接三元组最弱边以减少间接边。贝叶斯网络学习有向图与概率模型，边天然有向，但计算昂贵、样本需求高且要求无环，不适于富反馈调控电路。统计方法留下两个问题：相关和互信息不能定向，贝叶斯网络难扩展至基因组规模。
5. Machine Learning Predicts GRNs Based on TF Expression
ML方法问每个基因表达能由所有TF表达预测得多好。GENIE3用随机森林为每个靶基因建模，将TF重要性转为有向排序边，可扩展全基因组、容纳反馈并捕捉非线性组合效应。GRNBoost2用梯度提升加速，适用于数万细胞单细胞数据并作SCENIC引擎。其他方法加入生物学知识：模块网络推断整个模块的调控因子；Inferelator结合TF–靶基因先验和TF活性估计。评估表明先验信息方法优于仅表达方法。
6. The Single-Cell and Multi-Omic Data for GRNs
单细胞转录组学解析细胞类型、稀有细胞和发育中间态，使问题转向特定细胞与阶段的调控。植物资源包括拟南芥根图谱、玉米单细胞顺式调控图谱、水稻整合图谱、scPlantDB和Plant Cell Atlas。该时代工具多源于SCENIC：推断共表达模块，保留富集候选TF基序的模块，并评分regulon活性。多组学整合染色质可及性与表达：SCENIC+经增强子连接TF与靶基因；CellOracle进行in silico扰动；Dictys用足迹建模；Pando用pooled CRISPR验证；FigR和scMTNI等。伪时序和RNA velocity也用于定向。植物特异工具MINI-EX、MINI-AC、scPlant和scPlantReg编码植物基序、窗口和注释。领域已从组织平均走向细胞类型分辨网络。
7. Learning the Regulatory Code from Genome Sequence
DL提出能否仅从DNA序列预测表达。序列模型从卷积网络到Enformer、Borzoi、AlphaGenome，DeepSTARR可预测并设计增强子。它们为网络推断提供独立证据：通过共表达统计连接TF与靶基因，并指示调控区是否含可信特征。另一类DL用于GRN推断本身：CNNC将基因对表达直方图作为图像分类；DeepSEM将网络学习为深度结构方程模型；图神经网络显式表示基因及关系。
8. Decoding the Gene Regulatory Code with Foundation Models
FMs为大规模预训练神经网络，可微调。两类：DNA语言模型/gFMs直接训练于基因组序列；单细胞FMs训练于数百万表达谱。植物gFMs包括AgroNT、PDLLMs和PlantCaduceus。单细胞FMs用于网络推断：Geneformer提出in silico deletion；scGPT从注意力提取候选网络；scFoundation、Universal Cell Embedding和scPRINT推进表示与网络声明。植物中scPlantLLM在超100万拟南芥细胞预训练，零样本注释准确率高达0.91，迁移玉米和水稻，并从注意力提取网络和调控枢纽。
9. Challenges, Validation and Benchmarking of GRN Inference in Plants
植物GRN推断面临多倍体同源拷贝、TF冗余、大重复基因组中远端调控元件、presence–absence variation、昼夜与环境波动等挑战；单细胞原生质体制备可诱导胁迫基因。技术上，多数物种缺乏注释、结合数据和基序。非植物基准DREAM5、BEELINE、geneRNIB和CausalBench显示简单方法常匹配或超越复杂模型。植物仅有个别研究内评估：拟南芥氮网络AUPRC为0.24，随机0.19，约三分之二边无支持；ConnecTF整合TARGET、ChIP-seq和DAP-seq评分网络；整合网络优于输入且75% ROS调控因子有表型支持；玉米共表达富集ChIP-seq靶标，104个TF ChIP-seq为作物最大体内参考。但无标准化植物基准，缺乏大规模功能ground truth，pooled TF扰动受细胞壁、转化再生和冗余限制；参考多描述物理结合而非功能调控，同一数据常既作先验又作金标准，且集中于拟南芥、水稻和玉米。
10. The Road from Association to Explanation
二十年算法仅爬升至第3级。第一天花板是转录本作为TF活性代理不足：DELLA、JAZ和Aux/IAA受蛋白酶体降解调控，蛋白活性可独立或反向于mRNA；DREAM5发现E. coli中TF与靶标mRNA相关而S. cerevisiae中不相关；这些调控因子缺乏经典DNA结合域且低表达。解决可测DAP-seq结合和ATAC-seq可及性，或从靶标集推断TF活性；MINI-EX结合后两者。第二天花板在数据种类：哺乳动物pooled单细胞CRISPR筛选已改变实践，Pando经此类筛选测试，最新基准用扰动数据作ground truth；植物此级证据缺失。TARGET等瞬时系统数天提供扰动读出，诱导激活时间过程和原生质体平台使pooled递送可行，植物Perturb-seq具变革性。但AI输出仍为排序假设：拟南芥氮网络约三分之二边无支持；扰动方法未优于观察方法；五个单细胞FMs未优于线性基线；in silico扰动描述表示位移而非活细胞；注意力网络仍为第1–2级。FMs应作假设引擎，在lab-in-the-loop中选最不确定且重要边，用快速实验或pooled筛选测试，反馈优化模型，将五千万候选对压缩为几百条边。方法选择随数据：bulk用GENIE3/GRNBoost2和WGCNA；有结合数据用Inferelator或DAP-seq过滤；scRNA-seq用MINI-EX；染色质/多组学用MINI-AC、SCENIC+或CellOracle。陷阱包括过拟合、批次效应和间接边假阳性，建议自建小型ground truth评分工具。
11. Conclusions
植物中建立TF到靶基因箭头极难，二十年计算工作使其逐渐清晰。经典统计绑定共变；ML锐化为有向排序；单细胞按细胞类型解析网络；多组学提供物理基础；序列模型读取调控语法；FMs有望跨细胞、组织和物种携带知识。但进展止于第3级：揭示可能箭头和结合位置，未证明扰动改变靶标表达。弥合差距需计算与实验分工：统计和ML快速初筛，单细胞和多组学置细胞背景，序列和FMs压缩为可测试假设，扰动实验最终仲裁并反馈。箭头不再仅被绘制，而是被赢得。
