基于微藻培养与超声辅助回收叶黄素当量类胡萝卜素的畜禽废水资源化利用研究

《Clean Technologies》：Livestock Effluent Valorization Through Microalgal Cultivation and Ultrasound-Assisted Recovery of Lutein-Equivalent Carotenoids

　　

摘要 畜禽废水既构成环境挑战，又可作为微藻生物过程潜在的营养源。本研究开发了一种整合上游—下游的序贯策略，将基于废水的普通小球藻（Chlorella vulgaris）培养与超声辅助类胡萝卜素回收相结合。首先采用单纯形重心混料设计（simplex-centroid mixture design），评估屠宰场废水、养猪废水和Bold基础培养基（Bold’s Basal Medium，BBM）作为培养组分。在所考察的混料域内，100%养猪废水产生最高的细胞浓度，模型预测值与实验验证值分别为5.08 × 106 和5.41 × 106 cells mL?1。营养物去除率依废水配方不同，NH4+–N最高达97%，PO43?–P达40%，化学需氧量（COD）达92%。随后，采用响应面法（response surface methodology，RSM）优化超声辅助类胡萝卜素提取。模型选定的操作条件为25%振幅和10 min；实验测试获得分光光度法测定的叶黄素当量含量（lutein-equivalent content，LEC）为116.80 mg kg?1，提取物纯度指数为2.39，而模型估计值分别为118.47 mg kg?1和2.42。本研究证明了在实验室规模下将废水配方与后续色素回收进行实验性衔接的可行性，同时指出了需要进一步研究的分析、能量及放大方面的局限性。

一、研究背景与问题

全球食品生产需求的持续增长导致畜禽废水大量产生，尤其是屠宰场和集约化养猪场排放的废水。这类废水含有高浓度的氮、磷、悬浮固体和可生物降解有机物，若未经妥善处理直接排放，会导致水体富营养化、间接贡献温室气体排放、消耗受纳水体中的溶解氧，进而造成水生生态系统退化。传统上，畜禽废水被视为一种需要处理后方可排放的环境负担。然而，循环生物经济和资源回收理念的兴起促使研究者重新审视这些废物流，将其视为可替代初级生态系统服务的宝贵二次资源。微藻作为一种生物平台，具有同化无机营养物并将太阳能和大气CO₂转化为富含高附加值分子化合物的生物质的突出能力。与仅以污染物去除为目标的传统生物处理系统相比，微藻培养能够在修复废水的同时生产生物质，兼具环境保护和生物制品制造的双重功能。普通小球藻因其生长速度快、生理耐受性强、代谢灵活以及对废水成分变化具有较大耐受性，成为废水培养研究中最受关注的物种之一。在微藻积累的高价值化合物中，叶黄素因其在营养保健品、食品、制药、化妆品和动物饲料等领域的广泛应用而被认为是最具经济价值的类胡萝卜素之一。

尽管上游培养和下游提取各自都获得了大量研究关注，但这两者在很大程度上仍被作为独立过程进行研究。多数基于废水的培养研究止步于生物质生产，而提取研究通常使用市售或实验室培养的生物质，未考虑培养条件对下游回收的影响。从过程工程角度看，孤立地优化单一单元操作并不一定能最大化整个生产链的总体性能。在废水基微藻生物精炼厂中，培养介质组成直接影响生物质生理状态、细胞组成、色素积累以及最终的提取性能。因此，亟需开发能够将生物质生产和代谢物回收纳入统一过程框架的整合优化策略。本研究的创新之处不在于单独使用混料设计或超声辅助提取，而在于将两者在单一框架内进行序贯实验整合：通过单纯形重心优化选定的培养条件经实验验证后，在该上游条件下产生的生物质被用作下游超声优化的原料，从而在废水配方、微藻生长、生物质收获和色素回收之间建立了实验性联系。

二、研究内容与主要结论

本研究旨在开发和实验评估一个整合畜禽废水培养普通小球藻与超声辅助类胡萝卜素回收的序贯上游—下游框架。研究首先通过单纯形重心混料设计确定有利于细胞生产的废水配方，随后采用中心复合设计确定适合色素回收的超声处理条件，并特别关注实验验证以及影响解释和未来放大的分析与过程局限性。研究结果表明，在光照筛选实验中，红色LED光在40 μmol photons m^?2 s^?1辐照度下获得最高最终细胞浓度（7.25 × 10⁶ cells mL^?1），该条件被用作后续所有实验的标准光照条件。混料设计实验显示，生物质产量在2.58 × 10⁶至5.41 × 10⁶ cells mL^?1之间变化，100%养猪废水产生的产量比仅用屠宰场废水高出约110%。线性Scheffé混料模型被选为最佳拟合模型，模型预测最优配方（100%养猪废水）的生物质浓度为5.08 × 10⁶ cells mL^?1，实验验证值为5.41 × 10⁶ cells mL^?1，相对误差仅为6.45%。营养物去除实验表明，在优化培养条件下，NH₄⁺–N去除率最高达97%，PO₄^3?–P达40%，COD达92%。下游超声辅助提取优化采用可旋转中心复合设计，以超声振幅和提取时间为自变量，以叶黄素当量含量和提取物纯度指数为响应变量。模型选定的操作条件为25%振幅和10 min，实验验证获得叶黄素当量含量116.80 mg kg^?1和纯度指数2.39，与模型估计值118.47 mg kg^?1和2.42高度吻合。

三、关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：单纯形重心混料设计（simplex-centroid mixture design）用于优化培养介质中屠宰场废水、养猪废水和Bold基础培养基（BBM）的相对比例；响应面法（response surface methodology，RSM）中的中心复合设计（central composite design，CCD）用于优化超声辅助提取的振幅和提取时间；超声辅助提取（ultrasound-assisted extraction）技术用于破碎微藻细胞壁并促进胞内类胡萝卜素的释放；皂化和己烷—水相分配用于纯化提取物；分光光度法在445 nm波长下测定叶黄素当量含量并计算纯度指数。废水样本采集自墨西哥新莱昂州的两家畜牧加工设施，包括新鲜屠宰场废水和养猪废水，所有培养实验使用同一批次废水以保证理化特征一致。

四、研究结果

4.1 光照条件的初步筛选

研究人员在10天培养期内评估了蓝、红、白三种LED光谱在40和80 μmol photons m^?2 s^?1两种辐照度下的效果。红色LED光在40 μmol photons m^?2 s^?1条件下获得最高最终细胞浓度7.25 × 10⁶ cells/mL，其他处理产生的生物质浓度为2.37 × 10⁶至5.69 × 10⁶ cells/mL。Tukey检验显示三个最佳处理之间无统计学显著差异，但红色LED处理具有最高平均生物质浓度，故被选为后续所有优化的标准光照条件。

4.2 培养介质的优化

4.2.1 不同废水配方下的生物质生产

在单纯形重心混料设计中，生物质产量从2.58 × 10⁶到5.41 × 10⁶ cells mL^?1不等，跨实验域差异达2.10倍。100%养猪废水处理的产量比仅用屠宰场废水高出约110%。二元和三元配方均未产生优于纯养猪废水的响应，表明在该混料空间内，单一废水的理化特性优势超过了任何正面的组分交互作用。

4.2.2 单纯形重心混料模型的开发与验证

线性Scheffé混料模型被选为最佳拟合模型，统计上高度显著（p = 0.0003），R²为0.9005，调整R²为0.8721，预测R²为0.7555。模型预测最优配方（100%养猪废水）的生物质浓度为5.08 × 10⁶ cells mL^?1，实验验证值为5.41 × 10⁶ cells mL^?1，相对误差仅6.45%，表明模型具有良好的预测实用性。

4.2.3 响应面分析与数值优化

等高线图显示细胞浓度随养猪废水比例增加而逐渐升高，而用屠宰场废水替代则使预测生物质值降低。数值优化确定最优配方位于养猪废水顶点（100%），表明该响应是由组分驱动的顶点最优而非内部混料最优。这一结果与文献中常见的内部混料最优不同，说明在本研究条件下，屠宰场废水或BBM的添加均未纠正养猪废水中的营养限制或稀释抑制因素。

4.2.4 不同废水配方下的总可提取脂质积累

总可提取脂质含量在不同配方间差异显著，从约7%到25%（干重基础）不等。值得注意的是，产生最高生物质浓度的配方（100%养猪废水）并非脂质含量最高的处理。处理6产生最高的脂质积累，而处理9和10的脂质分数最低。这一结果与普通小球藻已知的代谢权衡一致：在最优营养条件下，同化碳优先用于细胞分裂、蛋白质合成和叶绿体发育，促进快速生物质积累，而脂质积累通常与中等营养胁迫相关。

4.2.5 废水组成对整合生物精炼发展的生物学意义

研究揭示废水选择不仅影响生物质生产力，还显著影响收获生物质的表型和生化组成。最大生物质产量与最高脂质含量未在同一配方中出现，表明生物质最大化和目标生化产物最大化应被视为独立的优化目标。此外，未发现任何二元或三元配方优于纯养猪废水，说明在评估条件下，单一废水已提供适宜的微藻理化环境，混料步骤可能过度复杂化过程而无可观察的生物学收益。

4.3 培养过程中的营养物去除与废水增值

营养物去除实验证实优化废水配方可同时维持微藻生长和废物去除。NH₄⁺–N去除率最高达97%，PO₄^3?–P达40%，COD达92%，依废水配方不同而异。研究强调这些去除率应被解释为生物废水处理的整合结果，而非单一主导机制的证据，因为实验未在藻类同化、细菌硝化、氨挥发、磷沉淀和微生物COD降解之间进行实验性分配。

4.4 超声辅助提取的响应面优化

采用可旋转中心复合设计优化超声辅助色素回收，以超声振幅（20.86%至49.14%）和提取时间（2.76至11.24 min）为自变量。多响应数值优化基于期望函数确定候选操作条件为25%振幅和10 min。实验验证获得叶黄素当量含量116.80 mg kg^?1和提取物纯度指数2.39，与模型估计值118.47 mg kg^?1和2.42高度吻合，验证了模型的预测能力。

五、讨论与结论

讨论部分强调，废水增值应被视为过程强化的一部分而非低成本生产的直接证据。微藻生物过程可能需要大量的能量和物质投入用于曝气、混合、收获、脱水、干燥、细胞破碎、提取和溶剂回收。在高价值色素生产中，即使培养营养物来自废物流，这些下游操作也可能构成重要的能量和经济瓶颈。废水基类胡萝卜素生产的整体竞争力最终取决于培养和下游回收操作的整合与优化。研究还指出，响应面应被视为局部插值方法，仅在被考察的组成域内有效，季节性废水变化、有机负荷波动、营养物浓度、悬浮固体和放大规模的水动力学都可能影响最优组成，需要在更大规模培养系统中进行连续运行验证后方可推广至工业应用。

结论部分指出，本研究成功开发和实验评估了一个序贯上游—下游框架，将基于养猪废水的普通小球藻培养与超声辅助类胡萝卜素回收相结合。单纯形重心混料设计确定100%养猪废水为最优培养配方，实验验证误差仅6.45%；中心复合设计确定25%振幅和10 min为最优超声提取条件，实验验证的叶黄素当量含量和纯度指数与模型预测高度一致。该研究在实验室规模上证明了废水配方与后续色素回收之间实验性衔接的可行性，为废水基微藻生物精炼厂的整合优化提供了重要的方法学基础。然而，研究也明确指出分光光度法无法提供叶黄素的明确化合物特异性鉴定，需要HPLC-based类胡萝卜素谱分析才能进行确定性定量，同时能量消耗和放大问题仍需进一步研究。