异喹啉生物碱在植物提取物中的含量测定及其体外与计算机模拟方法对人黑色素瘤细胞的胆碱酯酶抑制活性与细胞毒性研究

《Molecules》：Determination of the Content of Isoquinoline Alkaloids in Selected Plant Extracts and Study of Their Cholinesterase-Inhibiting Activity and Cytotoxicity Against Human Melanoma Cells Using In Vitro and In Silico Methods

　　

摘要：已知含有异喹啉生物碱的不同植物表现出多种生物活性，如抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗高血糖、降胆固醇、抗真菌和抗癌行为。造成重大健康负担的疾病包括神经退行性疾病和癌症。目前针对这些疾病的治疗方法仍不充分，因此需要新的治疗药物来更有效地治疗它们。本研究旨在测定从波尔多树（Peumus boldus Molina（Monimiaceae））叶片、黄连（Coptis chinensis Franch.（Ranunculaceae））根茎、非洲防己（Jateorhiza palmata（Lam.）Miers（Menispermaceae））根部、加州罂粟（Eschscholzia californica Cham.（Papaveraceae））全草以及厚朴（Magnolia officinalis Rehder & E.H.Wilson（Magnoliaceae））的树皮、花蕾和花中获得的植物提取物中选定异喹啉生物碱的含量。研究目的还包括在体外和计算机模拟（in silico）条件下测定所研究的异喹啉生物碱及含有它们的植物提取物对乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）和丁酰胆碱酯酶（butyrylcholinesterase，BChE）的抑制活性。所研究的生物碱标准品及大多数所研究的植物提取物表现出显著的抗胆碱酯酶活性。从黄连根茎获得的提取物对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶表现出最高的活性，IC50分别为4.85和9.58 μg/mL。动力学结果表明，波尔定（boldine）以非竞争性方式、黄连碱（coptisine）以竞争性方式、以及非洲防己碱（columbamine）以混合模式抑制乙酰胆碱酯酶活性。黄连碱和非洲防己碱以混合模式抑制丁酰胆碱酯酶活性。研究的下一目标是测定所测试的植物提取物对人黑色素瘤A375和SK-MEL-3细胞系的细胞毒性活性。观察到从黄连根茎获得的提取物具有最高的细胞毒性，对A375和SK-MEL-3细胞的IC50分别为4.06和27.3 μg/mL。所有所研究的植物提取物对人黑色素瘤癌细胞和成纤维细胞均表现出大于1.0的细胞毒性活性选择性指数（selectivity index，SI），表明其对癌细胞相较于正常细胞具有选择性细胞毒性。黄连根茎提取物获得了特别高的选择性指数（17.27）。由于黄连根茎提取物对胆碱酯酶具有高抑制活性以及对人类黑色素瘤细胞具有显著细胞毒性，同时对成纤维细胞的毒性低十七倍以上，因此获得了特别有趣的结果；因此，黄连可能特别推荐用于进一步研究。

论文解读

一、研究背景与问题

神经退行性疾病和癌症是日益严重的公共卫生问题，其发病率不断上升且缺乏有效疗法。神经退行性疾病涉及中枢神经系统神经元的进行性退化和不可逆损伤，而癌症仍是全球主要死因之一。现有治疗药物存在疗效不足、毒副作用大及耐药性等问题，因此亟需开发新的治疗药物。植物来源的天然化合物因其多靶点作用和较低毒性而受到广泛关注，其中异喹啉生物碱（isoquinoline alkaloids）具有抗癌、抗炎、神经保护和心脏保护等多种药理活性，在治疗慢性多因素疾病方面具有潜力。然而，不同植物中异喹啉生物碱的组成及其对胆碱酯酶（cholinesterases）的抑制活性和对黑色素瘤细胞的细胞毒性尚缺乏系统研究。本研究旨在测定五种植物提取物中异喹啉生物碱的含量，评估其体外和计算机模拟的乙酰胆碱酯酶（AChE）与丁酰胆碱酯酶（BChE）抑制活性，并考察其对人黑色素瘤A375和SK-MEL-3细胞系的细胞毒性。

二、研究内容与结论

研究人员采用高效液相色谱-二极管阵列检测（HPLC-DAD）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对植物提取物中异喹啉生物碱进行定性和定量分析；采用Ellman法与HPLC-DAD联用测定生物碱标准品和植物提取物的胆碱酯酶抑制活性，并开展酶动力学研究确定抑制类型和抑制常数（K_i）；利用AutoDock Vina进行分子对接（molecular docking）模拟，评估生物碱与AChE和BChE活性位点的结合模式；采用MTT法测定植物提取物对黑色素瘤细胞和正常成纤维细胞的细胞毒性并计算选择性指数（SI）。植物材料来源包括波尔多树叶片、黄连根茎、非洲防己根部、加州罂粟全草以及厚朴树皮、花蕾和花。

三、研究结果

2.1 植物提取物中生物碱含量的测定：通过HPLC-DAD和LC-MS/MS分析，黄连根茎提取物中异喹啉生物碱含量最高，其中非洲防己碱（palmatine）含量为4.4539 mg/g干重，黄连碱（coptisine）为1.4502 mg/g干重，小檗碱（berberine）为0.9235 mg/g干重，还含有非洲防己碱（columbamine）和木兰花碱（magnoflorine）。加州罂粟全草提取物含有大量人血草碱（stylopine，1.4007 mg/g干重）以及小檗碱、白屈菜红碱（chelerythrine）、原阿片碱（protopine）、血根碱（sanguinarine）和斯氏紫堇碱（scoulerine）。厚朴各部位提取物均含木兰花碱，树皮中含量最高（0.0224 mg/g干重）。波尔多树叶片提取物中波尔定（boldine）含量为0.0577 mg/g干重。

2.2 生物碱标准品对胆碱酯酶的抑制活性：所有被测生物碱均抑制两种胆碱酯酶活性。对AChE抑制活性最弱的是原阿片碱（IC₅₀=69.86 μM），最强的是白屈菜红碱（IC₅₀=0.72 μM），黄连碱和非洲防己碱也表现出高活性（IC₅₀分别为0.91和1.74 μM）。白屈菜红碱、非洲防己碱和黄连碱对BChE的抑制活性（IC₅₀分别为2.15、2.75和5.74 μM）强于加兰他敏（galantamine，IC₅₀=6.31 μM）和利凡斯的明（rivastigmine，IC₅₀=8.38 μM）。

2.3 胆碱酯酶抑制动力学研究：Lineweaver–Burk和Dixon图分析表明，波尔定以非竞争性方式抑制AChE（K_i=0.29 μM），黄连碱以竞争性方式抑制AChE（K_i=0.34 μM），非洲防己碱以混合模式抑制AChE（K_i=0.34 μM）；黄连碱和非洲防己碱均以混合模式抑制BChE，K_i分别为0.38和0.46 μM。

2.4 植物提取物对胆碱酯酶的抑制活性：黄连根茎提取物对AChE和BChE的抑制活性最高，IC₅₀分别为4.85和9.58 μg/mL。加州罂粟全草提取物也表现出较高活性（对AChE和BChE的IC₅₀分别为6.57和15.78 μg/mL）。非洲防己根部提取物对AChE的IC₅₀为9.08 μg/mL，对BChE为47.50 μg/mL。波尔多树叶片提取物对BChE的活性（IC₅₀=34.51 μg/mL）高于对AChE的活性（IC₅₀=43.85 μg/mL）。厚朴花和花蕾提取物对两种胆碱酯酶的活性最低。

2.5 分子对接：对AChE，白屈菜红碱（?9.6 kcal/M）、波尔定（?9.5 kcal/M）和木兰花碱（?9.3 kcal/M）的结合能最有利；对BChE，原阿片碱（?10.2 kcal/M）、血根碱（?9.5 kcal/M）和黄连碱（?9.4 kcal/M）结合能最有利。配体-受体接触分析显示，木兰花碱与AChE全部八个关键残基相互作用，血根碱与BChE七个关键残基相互作用。分子对接评分与实验IC₅₀值不完全相关，对接结果主要用于比较配体在活性位点口袋内的容纳能力和接触模式。

2.6 植物提取物的体外细胞毒性：所有提取物对两种黑色素瘤细胞系均表现出细胞毒性。黄连根茎提取物活性最强，对A375和SK-MEL-3细胞的IC₅₀分别为4.06和27.3 μg/mL。所有提取物对癌细胞的选择性指数均大于1.0，其中黄连根茎提取物对A375细胞的选择性指数高达17.27，表明其对癌细胞的毒性远高于对正常成纤维细胞。

四、讨论与结论

分子对接结果表明，所分析的生物碱可通过多种非共价相互作用（疏水接触、氢键、π-堆积、盐桥等）容纳于胆碱酯酶结合口袋中，BChE活性位点因含有较小氨基酸残基而能容纳更多结构多样的配体。对接结果应视为预测性和补充性数据，而非抑制活性的独立确认。所有被测植物提取物均含有不同量的异喹啉生物碱并表现出显著的胆碱酯酶抑制活性和对黑色素瘤细胞的细胞毒性。黄连根茎提取物在抑制胆碱酯酶活性和抗黑色素瘤细胞毒性方面均表现突出，同时对成纤维细胞毒性低十七倍以上，因此被特别推荐用于进一步研究。加州罂粟全草和非洲防己根部提取物可推荐用于胆碱酯酶抑制活性的进一步研究；黄连根茎、加州罂粟全草、厚朴树皮和非洲防己根部提取物可推荐用于抗癌活性的进一步体内研究。厚朴花蕾和花提取物在胆碱酯酶抑制和细胞毒性方面活性最弱，不建议针对这些活性进行进一步研究。