《Biology》：Fish 3D Clustering App (F3DCA): A Non-Supervised Clustering Method with a Machine Learning Autoencoder for Analyzing 3D Trajectories of Three Fish Species
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中文摘要翻译：
鱼类行为因其与神经退行性过程等多方面的相关性而被广泛研究，因为神经退行性过程可损害运动控制、复杂行为、习惯化以及对环境刺激的反应。三维（3D）运动轨迹分析是分析鱼类复杂行为的手段之一。然而，现有的3D追踪软件虽然能够捕获鱼类的3D轨迹，但仍高度
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鱼类行为因其与神经退行性过程等多方面的相关性而被广泛研究，因为神经退行性过程可损害运动控制、复杂行为、习惯化以及对环境刺激的反应。三维（3D）运动轨迹分析是分析鱼类复杂行为的手段之一。然而，现有的3D追踪软件虽然能够捕获鱼类的3D轨迹，但仍高度依赖人工或半自动分析。此外，传统分析方法难以处理原始3D数据（X、Y、Z坐标）的高复杂度，人工/半自动流程引入主观人为偏差且耗时严重，凸显了开发全自动、无监督机器学习方法的必要性。本研究旨在开发一种结合机器学习的无监督聚类方法，利用鱼类3D坐标自动分析鱼类行为。为评估该方法性能，研究人员分析了五个不同的数据集，包括：（1）由斑马鱼（Danio rerio）、侏儒青鳉（Oryzias woworae）和玻璃猫鱼（Kryptopterus vitreolus）三种鱼类组成的种间数据集；（2）群体性别组成数据集；（3）尾鳍切除效应数据集；（4）习惯化时间效应数据集；（5）急性乙醇暴露对斑马鱼行为影响的数据集。该方法采用多种聚类算法，包括K-Means、BIRCH、高斯混合模型（Gaussian Mixture Model，GMM）和谱聚类（Spectral Clustering），并将其应用于每个数据集的3D轨迹数据。随后，研究人员使用轮廓系数（Silhouette Score）和戴维斯-布尔丁指数（Davies–Bouldin Index，DB）评估聚类性能，并进一步应用深度学习自编码器（autoencoder）改善潜在特征表示、增强聚类分离度。聚类结果进一步通过调整兰德指数（Adjusted Rand Index，ARI）和归一化互信息（Normalized Mutual Information，NMI）与预定义的实验分组进行比较，并结合传统行为终点进行定性解释。外部一致性因数据集和聚类算法而异。所提出的方法能够表征斑马鱼在不同实验条件下的3D运动轨迹模式差异，但当行为差异细微或高度重叠时，其分离能力可能下降。此外，本研究使用多个行为数据集对方法进行了评估；类似的框架可推广至斑马鱼神经退行性疾病模型，用于识别与疾病相关的运动模式和神经行为组织改变。最后，研究人员还开发了一个易于安装、输出可读的轨迹分析结果的用户友好型软件包，可用于生物医学研究。
论文解读文章
一、研究背景与问题
动物行为是神经、感觉、运动及生理过程的可观测输出，定量行为分析被广泛用于研究动物对内部状态和环境变化的响应。近年来，人工智能（AI）及机器学习（ML）方法，包括监督和无监督学习，已被证明能够通过时间和精度上的关键优势提高轨迹分析的有效性。在鱼类行为研究中，二维（2D）轨迹分析虽便捷，但由于斑马鱼在三维环境中游动，2D视图可能低估或扭曲游泳速度、峰值速度、角速度、贴壁行为、深度偏好、垂直位置和空间偏好等行为参数。因此，3D追踪及基于轨迹的分析方法日益被采用，以获取更精确的运动和行为测量结果。然而，现有3D追踪软件虽能捕获鱼类3D轨迹，仍高度依赖人工或半自动分析；传统分析方法难以处理原始3D数据（X、Y、Z坐标）的高复杂度，人工流程引入主观偏差且耗时。更重要的是，即使3D追踪实现自动化，后续下游分析通常仍要求研究人员预先定义、提取和计算刚性行为终点（如特定速度阈值或区域偏好），这种对预定义指标的依赖意味着隐藏在原始高维时空轨迹中的细微、复杂或新颖的行为模式往往被忽略。无监督机器学习通过在不引入人为偏差的情况下对原始轨迹数据进行聚类，为解决这一瓶颈提供了有力方案。然而，原始3D轨迹流高度复杂且含噪声，因此需要研究先进的特征提取方法（如深度学习自编码器）如何在聚类前优化原始数据。
二、研究内容与结论
本研究的主要目标是开发并评估一种自动化流程，能够直接从原始空间轨迹分析成年斑马鱼3D行为，从而消除手动终点计算的需求。研究人员开发了一个用户友好的、基于3D轨迹的聚类应用软件（Fish 3D Clustering App，F3DCA），能够使用K-Means、平衡迭代归约与聚类层次法（BIRCH）、高斯混合模型（GMM）和谱聚类四种机器学习算法生成输出聚类。随后使用戴维斯-布尔丁（DB）指数和轮廓系数计算生成聚类的分离能力，包括簇内和簇间指标。为改善轨迹模式的表征，研究人员应用基于深度学习的自编码器从3D轨迹数据生成线性三维潜在表示，并迭代训练以最小化重建误差，所得潜在表示用于提高四种聚类方法的簇可分离性。生成的聚类进一步与各数据集手动计算的行为终点进行比较，行为终点以热图数据形式汇总，作为评估自动聚类模式是否与传统行为测量一致的参考信息。此外，还开发了基于图形用户界面（GUI）的应用程序，以促进不同鱼类数据集3D轨迹数据的用户友好分析。
三、主要关键技术方法
研究人员使用斑马鱼（Danio rerio）、侏青鳉（Oryzias woworae）和玻璃猫鱼（Kryptopterus vitreolus）三种鱼类，在丙烯酸水箱（20 × 20 × 20 cm）中进行3D运动测试，每测试组同时测试六条鱼，以群体而非个体视频帧或个体轨迹作为生物学重复（n）。视频以50帧/秒、1280 × 720像素分辨率录制。使用idTracker（版本2.1）提取每条鱼每帧的X、Y坐标（顶视图）和Y、Z坐标（侧视图），随后使用F3LA工具计算每条鱼的X、Y、Z坐标。数据预处理包括基于Z-Score的离群值去除和标准缩放器归一化。聚类分析采用K-Means、BIRCH、GMM和谱聚类四种算法，应用于原始轨迹窗口特征、PCA变换特征和Conv1D自编码器潜在表示三种特征表示。自编码器采用Conv1D架构，编码器包含32、64、128个滤波器的卷积层，核大小分别为5、5、3，输出经展平后通过64单元全连接层压缩为8维潜在表示。聚类性能通过轮廓系数和DB指数评估，外部一致性通过ARI和NMI评估。
四、研究结果
（一）种间鱼类数据集聚类结果
在种间数据集中，自编码器变换后四种算法的轮廓系数从原始轨迹表示的约0.079至0.132提升至约0.546至0.658，DB指数从约2.21至3.28降至约0.46至0.55，表明内部簇紧凑性和分离性显著提高。然而，ARI和NMI值表明更紧凑的潜在簇并不一定直接对应预定义的物种标签，自编码器主要改善了轨迹表示的几何组织，而与实验物种组的对应关系仍取决于聚类算法。
（二）斑马鱼不同性别数据集聚类结果
在群体性别组成数据集中，自编码器变换显著改善了四种算法的内部聚类结构。K-Means的轮廓系数从0.140升至0.547，BIRCH从0.083升至0.671，GMM从0.164升至0.324，谱聚类从0.126升至0.484。DB指数分别从2.273降至0.795、2.767降至0.471、2.709降至2.252、2.282降至0.857。自编码器变换后ARI值分别为0.075、0.038、0.107和0.099，NMI值分别为0.096、0.083、0.105和0.108，表明自编码器显著改善了内部几何组织，而与预定义群体性别组成组的对应关系仍依赖方法。
（三）尾鳍切除效应数据集聚类结果
在尾鳍切除数据集中，自编码器变换显著改善了四种算法的内部簇紧凑性和分离性。K-Means的轮廓系数从0.132升至0.618，BIRCH从0.111升至0.576，GMM从0.072升至0.480，谱聚类从0.112升至0.609。DB指数分别从1.951降至0.708、2.289降至0.725、2.710降至1.985、2.009降至0.665。与其他数据集不同，该数据集在自编码器变换后外部一致性也得到改善。K-Means的ARI从0.033升至0.087，BIRCH从0.050升至0.095，GMM从0.061升至0.091，谱聚类从0.076升至0.089；NMI也分别从0.041升至0.100、0.053升至0.109、0.087升至0.107、0.085升至0.101。这表明自编码器衍生的潜在表示同时改善了内部聚类几何和外部验证。
（四）斑马鱼习惯化过程不同时间观测数据集聚类结果
在习惯化数据集中，自编码器变换改善了四种算法的内部聚类结构，K-Means的轮廓系数从0.136升至0.455，BIRCH从0.101升至0.337，GMM从0.098升至0.277，谱聚类从0.131升至0.283。DB指数方面，K-Means从2.174降至0.944，BIRCH从2.343降至1.315，谱聚类从2.143降至1.127，而GMM从2.611升至3.106。外部一致性仍有限，ARI变化为K-Means从0.080至0.105、BIRCH从0.089至0.085、GMM从0.080至0.065、谱聚类从0.071至0.086；NMI分别从0.120至0.111、0.122至0.103、0.113至0.091、0.113至0.106。自编码器总体上改善了轨迹数据的几何组织，但无监督聚类与预定义习惯化时间点的对应关系仍较弱且依赖方法。
（五）急性乙醇暴露对斑马鱼行为数据集聚类结果
在急性乙醇暴露数据集中，自编码器变换后轮廓系数范围为0.195至0.474，DB指数范围为0.745至1.540。与原始轨迹表示相比，自编码器总体上提高了轮廓系数并降低了DB指数，表明簇紧凑性和分离性改善，但改善幅度因乙醇浓度和聚类方法而异，1.0%乙醇组出现若干小例外。自编码器变换后所有组合的平均轮廓系数为0.338 ± 0.085，平均DB指数为1.089 ± 0.259。乙醇相关的轨迹模式可通过聚类框架表征，但分离程度取决于乙醇浓度和聚类算法。
（六）手动计算行为终点的PCA和热图聚类
行为终点热图作为无监督聚类模式的补充定性参考。种间实验中，斑马鱼与玻璃猫鱼（K. vitreolus）表现出较相似的行为模式，而青鳉（O. woworae）因较低的运动活性和不同的探索行为而表现出更明显的行为差异。性别效应实验中，各组显示相对不同的热图模式，表明性别可能在斑马鱼行为表现中起作用。尾鳍切除实验中，切除组表现出最明显的行为模式差异，其次是切除加利多卡因处理组，未切除组和利多卡因处理组因行为模式相对相似而聚为一类。新颖水箱实验中，第一次和最后一次观测的鱼群聚为一类，其余组聚为另一类，可能表明第一分钟为习惯化过程，最后一分钟代表适应后的行为。急性乙醇暴露实验中，高浓度（1%）乙醇诱导了类似多动的行为改变，而低剂量乙醇未对整体行为产生显著影响。
（七）GUI操作
研究人员开发了基于Python的图形用户界面（GUI）应用程序，通过“start.bat”文件实现简易安装。用户可根据所需轨迹文件数量生成条目，以X、Y、Z轨迹数据文件形式输入，应用程序将使用传统聚类模型以及深度学习自编码器聚类生成结果。
五、讨论与结论
本研究表明，所开发的3D轨迹分析方法提供了一种更详细检查复杂行为反应的实用途径，聚类结果与传统行为终点作为补充定性信息进行比较。该方法评估斑马鱼完整的空间运动模式而非仅依赖总距离或平均速度等传统行为终点，能够通过基于轨迹的聚类捕获逃逸相关运动、应激诱导运动和神经肌肉性能的差异。在尾鳍切除实验中，切除组表现出与其他实验组不同的运动模式，但该改变不应仅归因于疼痛，可能涉及伤害性反应、操作应激和推进力生物力学损伤等多重机制。在急性乙醇实验中，1%乙醇处理组表现出比未处理和0.25%乙醇组更明显的轨迹模式差异，高剂量组运动测量变化与活动增加一致。自编码器变换后，K-Means、BIRCH和谱聚类通常比GMM在各数据集中表现出更高的轮廓系数，表明更好的簇分离性。与监督方法（行为终点计算）相比，无监督聚类方法显示出积极结果。种间实验中斑马鱼与玻璃猫鱼聚在一起，与行为终点计算结果一致，也与先前研究显示的斑马鱼和青鳉行为模式差异一致。性别差异结果与先前研究一致，成年全雄性群体表现出更高运动性，雌性表现出更稳健的探索行为。尾鳍切除组显示最明显热图模式差异，与行为终点计算结果一致。新颖水箱实验中两个主要聚类的发现合理，初始阶段鱼对新颖性表现出焦虑样行为反应，数分钟后逐渐增加探索。急性乙醇实验中高剂量组表现出最明显行为模式差异，与先前研究发现1%浓度急性乙醇暴露可增加鱼总移动距离一致。本研究存在局限性：当不同实验组表现出高度相似的运动模式时，聚类方法的分离能力降低；无监督聚类结果和传统行为终点源自相同的底层轨迹记录，两者的一致性用于比较分析方法而非独立生物学验证。
