CRISPR/Cas9介导的卵壳基因s36敲除损害瓜实蝇卵巢发育并完全抑制卵孵化

《Insects》：CRISPR/Cas9-Mediated Knockout of the Chorion Gene s36 Impairs Ovarian Development and Abolishes Egg Hatching in the Melon Fly Zeugodacus cucurbitae

瓜实蝇（Zeugodacus cucurbitae）（Coquillett）是一种全球入侵性葫芦科作物害虫，其幼虫隐蔽取食的特性限制了化学防治的效果，促使研究人员对基于生殖调控的治理策略产生兴趣。卵壳基因s36编码一种在双翅目中保守的卵壳蛋白。然而，s36是否参与瓜实蝇雌虫生殖仍不清楚。研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了纯合s36突变品系，并对其生殖表型进行了鉴定。s36的破坏显著降低了转录本丰度，并使预测蛋白质发生截短。突变雌虫在性成熟后死亡率升高，产卵量约下降一半，且所产卵无一孵化。所有检测的突变雌虫卵巢均明显缩小并被判定为异常；卵体积更小、色泽暗淡并在空气中迅速皱缩，表明卵壳完整性受损。两个卵黄原蛋白（vitellogenin）基因在卵巢中均下调。全身体转录组学鉴定出179个差异表达基因，富集于脂质与激素相关代谢通路。组织特异性RT-qPCR显示，卵黄原蛋白和yellow-g2转录本在脂肪体中升高，而在卵巢中降低；这一模式究竟反映卵黄前体向卵母细胞的转运障碍，还是这些基因正常表达的滤泡组织继发性丢失，尚有待确定。上述发现将s36确定为瓜实蝇正常卵巢成熟和卵活力所必需的基因，并为该害虫的遗传防控提供了一个候选靶点。

研究背景与科学问题

瓜实蝇（Zeugodacus cucurbitae）属于实蝇科（Tephritidae），是全球最具破坏性的果蔬害虫之一，偏好苦瓜、黄瓜等葫芦科植物。雌虫将卵产入发育中的果实内，幼虫在内部取食，导致果实腐烂脱落，严重时可造成几乎全部商品产量损失。由于幼虫阶段隐蔽于寄主组织中，叶面喷施的杀虫剂难以触及，而针对成虫的反复用药已在田间种群中筛选出抗药性，广谱杀虫剂的使用还带来非靶标危害。当前的综合管理依赖物理隔离、寄主源引诱剂和生物防治，但这些措施易受环境条件影响。因此，亟需开发高效、物种特异且与现有体系兼容的新型防控手段。

干扰雌虫生殖是一条富有前景的途径——产卵减少或卵无法发育的雌虫对下一代无贡献。昆虫卵子发生涉及生殖细胞与体细胞滤泡细胞的协同增殖、卵黄前体的大量摄取以及在成熟卵母细胞周围沉积卵壳。卵壳由滤泡上皮细胞在卵母细胞成熟末期分泌，主要由卵壳蛋白聚合而成，形成多层结构保护胚胎免受机械损伤和干燥，同时允许气体交换和精子进入。在卵壳组分中，s36是最早表达的卵壳基因之一，在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）和地中海实蝇（Ceratitis capitata）中均有研究，其编码和调控序列保守。在果蝇中靶向下调s36会破坏卵壳生物合成与结构，并使卵泡无法支持精子进入。然而，这些证据基于RNA干扰而非功能缺失等位基因，且s36是否同样为害虫雌虫生殖所需、其缺失是否影响卵壳组装上游的卵子发生过程，尚不清楚。研究人员假设，完全缺失s36会损害卵壳功能，并且由于卵壳沉积是紧密耦合的成熟程序的终末步骤，这种缺失也将在卵巢本身有所体现。此外，卵壳是限制外源分子进入昆虫卵的主要屏障，因此控制卵壳组装的基因直接影响基于递送的防控策略。通过完全功能缺失来表征s36，既能揭示卵壳如何构建，也能探索能否通过改变其组成来调节胚胎通透性。

研究设计与主要结论

为获得s36功能的直接遗传学证据，研究人员利用CRISPR/Cas9诱变技术，针对s36编码序列383–403 bp设计了一条sgRNA，对瓜实蝇进行胚胎显微注射，经筛选和传代建立了纯合s36突变品系（命名为s36^Δ8）。该突变携带21 bp缺失与4 bp插入，使预测蛋白从318个氨基酸截短至59个氨基酸，且s36转录本丰度降至野生型的9.33%。研究发现，s36功能缺失导致：（1）雌虫性成熟后死亡率显著升高（达59%），而突变雄虫及杂合子两性均无明显变化；（2）雌虫产卵量减少约一半（每雌31.67枚 vs. 野生型64.67枚）；（3）所产卵完全不能孵化；（4）卵巢明显萎缩，所有被检突变雌虫的卵巢均被判定为异常，无可视成熟卵母细胞；（5）突变卵体积小、表面粗糙无光泽，暴露于空气后120秒内即逐渐皱缩，表明卵壳完整性受损且无法有效保水。这些结果证明s36是瓜实蝇正常卵巢成熟和卵活力所必需的基因。

关键技术方法

1. 1.
   CRISPR/Cas9基因编辑：通过胚胎显微注射将sgRNA与Cas9蛋白混合物注入瓜实蝇早期胚胎，经测序筛选获得编辑个体，并通过回交和杂合子互交建立稳定遗传的纯合突变品系。2. 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）：以rps3为内参基因，检测s36、卵黄原蛋白基因Vg-1和Vg-2以及yellow-g2在全虫体及分离的脂肪体和卵巢组织中的相对表达水平。3. 全身体转录组测序（RNA-seq）：对性成熟纯合突变雌虫与杂合对照雌虫进行转录组测序，通过差异表达基因（DEGs）分析、基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分类，并结合基因集富集分析（GSEA）探索分子机制。4. 形态学观察与表型测定：采用超景深显微镜三维重建观察卵巢和卵形态，记录卵在空气中随时间变化的皱缩过程，并称量卵重以评估失水情况。

研究结果

3.1 纯合s36突变品系的建立：通过CRISPR/Cas9靶向s36，从35头G₀成虫中鉴定出24头编辑个体，F₁代18头成虫均为携带突变的编辑个体，共获得6种独立突变类型。选取携带最早提前终止密码子的s36^Δ8等位基因用于功能分析，纯合突变雌虫的s36转录本丰度仅为野生型的9.33%（p < 0.001）。

3.2 s36缺失提高雌虫死亡率并降低产卵量：性成熟后21天累计死亡率在纯合突变雌虫中达59%，显著高于纯合突变雄虫（28.78%）及杂合子两性（约26–32%）。纯合突变雌虫平均每雌产卵31.67枚，较野生型（64.67枚）减少51.03%（p < 0.01）。野生型卵孵化率为54.34%，而突变卵无一孵化。

3.3 s36缺失损害卵巢发育与卵壳完整性：纯合突变雌虫的卵巢明显缩小，所有被检卵巢均被判定为异常，卵母细胞不可见。突变卵较小、表面粗糙无光泽，暴露于空气后120秒内逐渐皱缩，而野生型卵保持形状不变，突变卵重量随暴露时间延长显著下降。

3.4 s36破坏后的转录组响应：全身体转录组比较鉴定出179个差异表达基因（108个上调，71个下调）。GO富集涉及脂质分解代谢、甘油三酯代谢、磷脂生物合成、细胞葡糖醛酸化及肽激素应答等过程。KEGG分类中多数DEGs归属于代谢通路，包括昆虫激素生物合成、类固醇激素生物合成、鞘脂代谢等。

3.5 卵黄原蛋白和Yellow-g2转录本在脂肪体中积累但在卵巢中耗竭：GSEA显示脂质与动脉粥样硬化通路和内吞作用在突变体中受抑制，昆虫激素生物合成通路正富集。RT-qPCR证实Vg-1、Vg-2和yellow-g2在全虫体中上调约2倍。组织分离检测发现，这三个基因在脂肪体中均升高（Vg-1增幅最大），而在卵巢中均降至对照水平的约1/4至2/5。

讨论与结论

研究表明，s36缺失完全阻断了卵孵化并将产卵量减半，所产卵小而暗淡、表面粗糙、暴露于空气后迅速皱缩，这与果蝇中s36敲低导致的卵壳结构紊乱表型一致。值得注意的是，生殖缺陷不仅限于卵壳：卵巢明显萎缩，两个卵黄原蛋白基因在卵巢中显著下调。这可能有两种解释：一是s36仅作用于卵壳，卵黄基因表达下降是卵母细胞成熟停滞的继发后果；二是主要滤泡分泌产物的丢失更广泛地扰乱了滤泡上皮，进而反馈影响卵黄摄取。突变雌虫性成熟后死亡率升高，最可能反映了卵巢反复启动却无法完成卵子发生的生理负担。转录组分析提示脂质和激素相关代谢偏移，但差异基因数量较少且未经功能验证。组织特异性表达数据显示卵黄前体可能在合成部位（脂肪体）积累但未能有效递送至或滞留于卵母细胞，不过这一推断来自转录本丰度而非蛋白质水平证据，也可能仅反映萎缩卵巢中滤泡组织的丢失。从应用角度看，纯合s36缺失产生完全不育雌虫，而雄虫和杂合子存活，符合雌杀或昆虫不育策略所需的基因型特征；此外，卵壳屏障的削弱也为增加胚胎通透性、递送dsRNA等生物活性分子提供了潜在操作靶点。

研究结论：本研究通过CRISPR/Cas9诱变成功构建了瓜实蝇纯合s36突变品系，并系统鉴定了其生殖表型。s36缺失使转录本丰度降至极低水平，产卵量减半，卵孵化完全丧失，所有被检雌虫的卵巢均明显萎缩并被判定为异常，所产卵外观暗淡并在空气中数秒内即肉眼可见皱缩。突变雌虫卵巢中卵黄原蛋白基因下调而脂肪体中上调，全身体转录组呈现脂质与激素相关代谢偏移及内吞作用的探索性抑制。这些转录层面的观察与卵黄前体递送受阻一致（但未证实），也可能反映萎缩卵巢中滤泡组织含量的减少。上述发现确立了s36为瓜实蝇正常卵巢成熟和卵活力所必需的基因，并为该全球入侵性害虫的基于生殖的遗传防控提供了一个候选靶点。