《Journal of Marine Science and Engineering》：Comparison of Bacterial and Potentially Pathogenic Bacterial Communities in Ballast Water from Different Source Waters
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压载水可在不同水生环境之间转运微生物，包括潜在致病菌（potentially pathogenic bacteria, PPB）。本研究采用16S rRNA基因扩增子测序技术，对11份压载水样本中的细菌群落及PPB类群进行了分析。依据取水国别及水体类型，样本被
压载水可在不同水生环境之间转运微生物，包括潜在致病菌（potentially pathogenic bacteria, PPB）。本研究采用16S rRNA基因扩增子测序技术，对11份压载水样本中的细菌群落及PPB类群进行了分析。依据取水国别及水体类型，样本被划分为六个组别。PERMANOVA分析显示，各组间总细菌群落组成存在显著差异（p = 0.037），而PPB群落组成未见显著差异（p = 0.138）。变形菌门（Pseudomonadota）为所有样本中的优势菌门。基于序列相似性及参考数据库和已发表文献中的致病性信息，共鉴定出51个种水平PPB相关扩增子序列变体（amplicon sequence variants, ASVs）。多个PPB相关ASVs与环境变量呈显著相关，尤其与溶解氧（dissolved oxygen, DO）关系密切。研究人员采用综合风险指数（Integrated Risk Index, IRI）对各来源组PPB类群的相对特征进行比较。澳大利亚海水组被划入中等IRI等级，其余五组均属低等级。鉴于样本量有限且缺乏致病性的直接验证，上述结果应视为探索性发现，可为未来压载水微生物监测提供基线信息。
压载水微生物群落研究解读
一、研究背景与科学问题
国际海运承担了全球约80%–90%的货物贸易运输量，压载水（ballast water）对维持船舶稳定性和航行安全至关重要。然而，压载水同时也是海洋生物及微生物跨区域迁移的重要媒介，不仅可导致非本地物种的引入，还可促进病原微生物的传播，对海洋生态系统、渔业及公共健康构成潜在威胁。为应对上述问题，国际海事组织（International Maritime Organization, IMO）通过了《国际船舶压载水及沉积物控制与管理公约》（BWM公约），该公约于2017年生效，要求国际航行船舶实施压载水管理。目前，IMO D-2标准仅将霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、大肠杆菌（Escherichia coli）和肠道肠球菌列为指示微生物，但近年研究已在压载水中检出更广泛的伺机性病原菌，包括弧菌属（Vibrio）、军团菌属（Legionella）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、气单胞菌属（Aeromonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）和青枯菌属（Ralstonia）等。
早期压载水微生物研究主要依赖培养法，而16S rRNA基因扩增子测序技术的引入使得包括不可培养微生物在内的细菌群落表征更为全面。尽管该技术在种水平分类分辨率和致病性直接判定方面存在局限，但已成为环境样本细菌群落组成及潜在致病菌分布研究中最广泛使用的方法之一。目前，系统比较不同压载水来源类型间PPB群落组成、并探讨其与环境变量关系的研究仍相对缺乏，将PPB群落信息整合到相对生物安全风险评估中的研究亦不多见。为此，研究人员开展了此项先导性研究。
二、研究设计与技术方法
本研究共采集11份压载水样本，来源于2018年4月17日至2019年7月25日间抵达韩国国内港口的国际商业船舶。依据取水国别与水体类型的组合，样本被划分为六个来源组：澳大利亚海水组（AS，n = 2）、日本海水组（JS，n = 2）、日本半咸水组（JB，n = 1）、中国海水组（CS，n = 3）、中国河水组（CR，n = 2）及中国半咸水组（CB，n = 1）。样本采集严格遵循IMO压载水采样指南（G2），每船无菌采集2 L压载水，其中1 L用于细菌群落分析，另1 L用于理化分析。微生物富集采用0.22 μm聚碳酸酯膜过滤，滤膜于?80 °C保存至DNA提取。
关键技术方法包括：基于DADA2流程进行扩增子序列变体（ASV）生成与去噪；采用BLAST+比对NCBI 16S rRNA参考数据库进行物种注释，仅保留序列相似度>98.7%的种水平ASV用于PPB分析；通过增强型传染病数据库（EID2）、水产养殖细菌病原体数据库（ABPD）和人类致病菌数据库（HPBD）及文献资料进行PPB筛选与致病性分级；采用FAPROTAX数据库预测细菌群落功能特征；综合应用PERMANOVA、PERMDISP、Spearman秩相关、Mantel检验、CCA和RDA等多元统计方法；构建包含致病潜能指数（PPI）、环境压力评分（E）、功能风险评分（F）和PPB丰富度评分（R）四个组分的综合风险指数（IRI），权重分别为0.40、0.25、0.20和0.15。
三、主要研究结果
3.1 采样点与环境条件
11份样本的水温范围为10.92–29.25 °C，pH为7.26–8.04，盐度为0.11–36.03 PSU，溶解氧（DO）为0.83–9.22 mg/L，浊度为1.02–167.00 NTU。盐度清晰区分了三种水体类型。主成分分析（PCA）显示前两个主成分解释了环境变量总变异的53.5%，盐度、溶解性有机碳（DOC）、溶解性无机氮（DIN）和溶解性无机磷（DIP）是样本间差异的主要贡献因子。
3.2 总细菌与PPB群落多样性
六组间总细菌的ASV丰富度（均值122–368）、Shannon多样性（均值2.99–4.21）及Faith系统发育多样性均无显著差异（Kruskal–Wallis检验，p > 0.05）。但PERMANOVA显示六组间总细菌群落组成差异显著（R2 = 0.550，p = 0.037）。PPB群落的丰富度（均值5–13）和Shannon多样性（均值0.32–1.54）在组间亦无显著差异，PERMANOVA未检测到PPB群落组成的显著组间差异（R2 = 0.531，p = 0.138），但样本量有限限制了解释力度。
3.3 PPB群落的分类组成
变形菌门（Pseudomonadota）为所有样本的优势菌门，约占60%–95%；纲水平以γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）和α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）为主。PPB群落同样以变形菌门和γ-变形菌纲为主导。属水平上，弧菌属（Vibrio）为主要PPB属，沙雷氏菌属（Serratia）、贪铜菌属（Cupriavidus）、青枯菌属（Ralstonia）、微杆菌属（Microbacterium）、分枝杆菌属（Mycobacterium）等亦有贡献。共鉴定出51个种水平PPB相关ASVs，其中5个归类为病原菌（Pathogen），30个为潜在病原菌（Potential pathogen），16个为病原相关菌（Pathogen-associated bacteria）。检出率最高的为Cupriavidus metallidurans（81.8%），其次为Serratia nematodiphila（63.6%）、Acinetobacter junii（45.5%）、Actibacter haliotis（45.5%）和Vibrio chagasii（36.4%）。Venn分析显示，PPB群落中3个ASVs为三种水体类型共有，海水、河水和半咸水分别有29、5和5个独有ASVs；按取水国别计，4个ASVs为三国共有，中国拥有最多的独有PPB ASVs（17个）。
3.4 PPB的环境关联
Spearman秩相关分析经Benjamini–Hochberg FDR校正后，DO与5个种水平PPB相关ASVs（包括Serratia nematodiphila、Cupriavidus metallidurans、Ralstonia pickettii、Microbacterium hominis和Achromobacter aegrifaciens）及总PPB负荷呈显著负相关；浊度与Vibrio chagasii和Vibrio brasiliensis呈显著正相关；DIN与Vibrio alginolyticus呈正相关。Mantel检验未检测到环境变量与PPB群落组成间的显著关联（相关系数均<0.30）。CCA未发现显著环境关联，而RDA鉴定出浊度为显著环境变量。
3.5 PPB功能特征与风险评估
FAPROTAX预测功能包括化能异养、好氧化能异养、硝酸盐还原、发酵、反硝化和烃类降解等，亦预测了与人类病原体相关的功能（如医院感染、败血症、脑膜炎和肺炎）。澳大利亚海水组在若干人类病原相关功能类别中标准化得分较高。IRI计算结果显示，六组平均IRI值范围为0.09–0.53。澳大利亚海水组IRI为0.53，属中等等级；日本半咸水组（0.22）、中国半咸水组（0.18）、日本海水组（0.13）、中国河水组（0.12）和中国海水组（0.09）均属低等级。
四、讨论与结论
本研究发现变形菌门和γ-变形菌纲为压载水中优势类群，与既往研究一致。总细菌群落组成在组间存在显著差异，而PPB群落组成无显著差异，但有限且不均衡的样本量限制了解释力度。压载水中检出多种PPB表明其可能作为潜在致病菌长距离传播的载体。多数PPB相关ASVs与环境变量无显著相关，但DO与多个ASVs呈显著负相关。IRI作为一种描述性工具，整合了PPB相关信息以比较样本间相对风险，并非替代IMO监管标准，而是可作为补充工具。
研究存在以下局限：样本量有限且组间样本数不均衡；取水国别与水体类型的组合不完整，无法独立区分地理来源与水体类型的影响；缺乏压载水停留时间和船上处理历史的可靠信息；基于16S rRNA基因的种水平分类存在不确定性，且DNA检出不能确认细菌活性或致病性；IRI未直接量化实际生物风险。
结论部分指出：本研究在11份压载水样本中共鉴定出51个种水平PPB相关ASVs，其中5个为病原菌、30个为潜在病原菌、16个为病原相关菌。总细菌群落组成在六组间差异显著，而PPB群落组成无显著差异。多个PPB相关ASVs与溶解氧呈显著负相关。IRI将澳大利亚海水组归为中等等级，其余五组为低等级。鉴于样本量有限且缺乏致病性直接验证，上述结果应视为探索性发现，可为未来压载水微生物监测和生物安全研究提供基线参考。
