一种用于超灵敏检测外泌体PD-L1的免提取一锅法免疫磁-RPA-CRISPR/Cas13a平台

《Analytica Chimica Acta》：An extraction-free one-pot immunomagnetic-RPA-CRISPR/Cas13a platform for ultrasensitive detection of exosomal PD-L1

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  一种无需提取的一步法iMRO-HCRISPR平台在单一密闭管中集成了免疫磁珠捕获、RPA扩增和CRISPR/Cas13a信号扩增。
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  该平台的检测限可达10¹ 颗粒/mL，定量范围横跨八个数量级（10³–10¹¹ 颗粒/mL）。
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  该平台区分肝细胞癌（HCC）患者与健康对照的受试者工作特征曲线下面积（AUC）为0.964（P < 0.0001）。
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  介导的链置换纯化技术有效消除了非特异性结合，并显著降低了背景信号。
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  可替换抗体的设计允许适配其他肿瘤外泌体生物标志物，支持常规临床检测和快速即时检测（POCT）。

引言

细胞外囊泡（EVs）是细胞主动分泌的纳米级膜封闭囊泡，在血液、尿液和唾液等生物流体中大量存在[1,2]。EVs通过递送蛋白质、脂质和RNA介导细胞间通讯，其货物谱反映母细胞的生理和病理状态[3]。在肿瘤微环境中，肿瘤分泌的EVs——尤其是直径30至150 nm的外泌体——介导肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞之间的串扰，并调节肿瘤增殖、转移和免疫逃逸[4]。PD-L1作为核心免疫检查点调节因子发挥作用[5]。越来越多的证据表明，PD-L1不仅在肿瘤细胞膜上表达，还通过外泌体释放至外周循环中形成稳定的循环exo-PD-L1[6,7]。外泌体PD-L1与T淋巴细胞上的PD-1受体结合，抑制T细胞效应功能，促进肿瘤免疫逃逸[8]。循环exo-PD-L1浓度与肿瘤负荷、疾病进展及免疫治疗疗效高度相关，凸显了其作为液体活检标志物的潜力[9,10]。传统的分析工具，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、流式细胞术和Western blot，已被广泛用于exo-PD-L1的检测[11,12]，但这些方法受限于低检测灵敏度、大样本需求及高劳动强度的操作流程[13]，无法满足临床对微量标志物快速、精确量化的需求。因此，亟需新型超灵敏、简化的检测工具。

规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及CRISPR相关蛋白（Cas）构成了细菌抵抗病毒感染的适应性免疫机制[14]。CRISPR/Cas13a可独特地识别并切割靶标RNA转录本[15]。一旦crRNA引导的Cas13a与互补靶标RNA结合，其标志性的附带切割活性即被触发；活化的Cas13a非选择性降解附近的RNA底物，包括荧光报告RNA。这一独特特性使Cas13a成为超灵敏核酸检测的强大工具，适用于病原体鉴定和肿瘤标志物筛查[16]。现有的CRISPR/Cas13a应用主要集中在microRNA和长链非编码RNA的定量[17]。基于Cas13a构建的SHERLOCK平台实现了快速、高效的RNA检测，大幅提升了分子诊断的通量和准确性[17]。

恒温核酸扩增技术的进步，包括重组酶聚合酶扩增（RPA）和环介导等温扩增（LAMP）[18]，推动了简单而强大的外泌体蛋白超灵敏检测分析平台的开发。RPA可在37–42°C的恒定温度下快速扩增靶标DNA序列[19]。其基本原理是利用特异性引物结合靶标DNA；在重组聚合酶的催化下，进行连续的链置换反应，从而实现DNA的快速扩增[20]。RPA具有显著优势：操作简便、30分钟内快速读数、仪器需求最小，使其适用于即时检测（POCT）和常规临床诊断[20]。

在此，我们开发了一种高灵敏度检测平台——免疫磁性外泌体RPA一步法高灵敏度CRISPR/Cas13a（iMRO-HCRISPR）平台，用于快速、特异性识别循环血液外泌体上的PD-L1（示意图见图1）。iMRO-HCRISPR平台整合了三个核心模块：循环外泌体的免疫磁性富集、基于抗体识别外泌体表面PD-L1，以及通过RPA和Cas13a附带切割的级联信号扩增。我们在外泌体捕获前引入介导的DNA亲和性下拉技术，以优化DNA-抗体偶联物的纯化。结合夹心免疫分析的高特异性和RPA-CRISPR级联反应的指数级信号扩增，iMRO-HCRISPR可在低至10¹ 颗粒/mL的浓度下检测PD-L1阳性外泌体。该平台可实现微量外泌体PD-L1的精确量化，并有效区分临床确诊的HCC患者与健康对照受试者。

章节摘录

材料

本研究所使用的所有寡核苷酸序列汇总于表S1，由GENEWIZ合成并通过高效液相色谱（HPLC）纯化。抗人PD-L1单克隆抗体（克隆10084-MM39T）购自北京义翘神州生物公司。抗CD81、TSG101和ALIX的多克隆抗体购自武汉艾博抗生物技术有限公司。ABflo?647抗PD-L1/CD274单克隆抗体（货号A22305）购自艾博抗。该

iMRO-HCRISPR平台原理

我们成功建立了iMRO-HCRISPR检测平台，其工作原理如图1所示。该平台将夹心免疫分析与RPA-CRISPR/Cas13a级联信号扩增策略相结合，用于超灵敏定量循环外泌体上的PD-L1。简言之，样本中的外泌体首先被偶联了抗CD63/CD81/CD9抗体鸡尾酒的磁性珠捕获，随后与PD-L1抗体-DNA偶联探针孵育以

讨论

外泌体PD-L1是肝细胞癌（HCC）诊断和免疫治疗监测的有前景的液体活检标志物，该标志物的临床转化价值高度依赖于分析工具的灵敏度。然而，循环外泌体中PD-L1的丰度在临床样本中极低；这些微量水平的可靠定量仍然是临床转化的主要瓶颈，严重限制了外泌体PD-L1在

结论

总之，本研究构建了一种超灵敏的免疫磁性-RPA-CRISPR/Cas13a生物传感器，用于一步法（iMRO-HCRISPR）、无需提取的外泌体PD-L1定量。该平台整合了免疫磁性富集、DNA-抗体探针识别和多阶段核酸信号扩增。结合介导的DNA亲和性下拉纯化技术，有效降低了检测背景，实现了单颗粒水平的定性检测，并且

CRediT作者贡献声明

Hansen Shi：撰写–原稿、可视化、软件、数据整理。Jiayi Chen：软件、调查、数据整理。Xiaocong Lin：撰写–审阅与编辑、方法论。Yaning Zhang：调查、数据整理。Haiqi Wu：资源、调查。Biyun Zeng：方法论、调查。Peijun Zhang：调查、形式分析。Qianying Luo：软件、调查。Tiancai Liu：监督、项目管理、概念化。Tao Zeng：监督、项目

伦理声明

本回顾性研究经广东医科大学附属医院伦理委员会批准（批准号PJKT2026-021）。所有受试者在样本采集时均获得了书面知情同意。本研究按照《赫尔辛基宣言》的规定进行。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的相互竞争的经济利益或个人关系，这些利益或关系可能会影响本文所报告的工作。

致谢

本研究由广东省基础与应用基础研究基金（资助号2023A1515010235和2025A1515011140）、广东医科大学附属医院高层次人才启动基金（资助号GCC2026012）、国家自然科学基金委员会（资助号82372344）以及广东省自然科学基金（资助号2023A1515011925、2024A1515011850）资助。

Hansen Shi|Jiayi Chen|Xiaocong Lin|Yaning Zhang|Haiqi Wu|Biyun Zeng|Peijun Zhang|Qianying Luo|Tiancai Liu|Tao Zeng