基于 CCD 光谱积分的原位分析仪，用于增强动态范围的海水铵荧光检测

《Analytica Chimica Acta》：An in-situ analyzer based on CCD spectral integration for enhanced dynamic range fluorometric detection of ammonium in seawater

　　

• •
  CCD光谱积分增强了荧光法NH₄⁺的检测性能，并扩展了其动态范围。
• •
  一款全自动化rFIA-荧光分析仪在海水中实现了0.13-50 μmol/L的检测范围。
• •
  现场部署表明，该系统能够从寡营养海域到富营养化近海水体可靠地进行原位铵态氮测量。

引言

氮是海洋环境中限制浮游植物生长的营养元素，其供应在生态系统功能中起着核心作用[1,2]。在各类氮形态中，铵态氮（NH₄⁺）是最还原态的生物可利用无机氮形态，其周转迅速且优先被浮游植物吸收利用[3]。铵态氮既来源于生物代谢过程，也来源于人为输入，包括水产养殖和废水排放[4]。铵态氮浓度升高可加速富营养化、缺氧及水体毒性问题，对生态系统稳定性构成重大威胁[5]。因此，准确测定铵态氮对于理解氮循环和评估生态胁迫至关重要[4,6]。

在海洋环境中，NH₄⁺浓度跨越多个数量级，从寡营养开阔海域的纳摩尔级到富营养化近海水域的微摩尔级[7,8]。这种宽泛的动态范围，加上其对氧化和挥发等过程的敏感性，带来了巨大的分析挑战[4]。实验室间比对研究揭示了显著的不一致性，尤其在低浓度下偏差可达56%[9]，凸显了在不同环境中实现准确稳健的铵态氮定量所面临的困难。

目前已开发了多种铵态氮测定方法，包括离子选择性电极（ISE）法、靛酚蓝（IPB）比色法和邻苯二甲醛（OPA）荧光法[4,[10], [11], [12]]。ISE传感器因功耗低、响应快速且易于小型化而适合原位应用，但其有限的灵敏度限制了在海洋环境中的痕量级测量[12]。IPB比色法仍是海水铵态氮分析中应用最广泛的方法，近年来基于OPP的IPB方法的改进大幅提升了其稳健性和自动化监测适用性[[13], [14], [15], [16], [17]]。然而，比色试剂的长期稳定性仍是延长自主部署的难题。相比之下，OPA荧光法因其高灵敏度和无需预浓缩即可实现低检测限的能力而占据主导地位。与连续流系统耦合后，该方法可实现高通量、高分辨率的环境测量[12,18]。

近年来，大量研究致力于改进荧光法铵态氮检测，推出了一系列性能更优的自动化分析仪（表S1）。这些进展主要围绕试剂优化、流体设计和光学构型展开。尽管取得了这些进步，但仍存在一个一致的模式：低浓度下灵敏度的提升往往伴随检测上限的降低，反之亦然。灵敏度和动态范围之间这一持续存在的权衡关系表明，现有系统仍受限于传统的信号采集策略。大多数现有荧光系统依赖单通道硬件集成测量，即在预定义光学带宽内采集的荧光光子被转换为单一标量强度输出。尽管基于光谱仪的方法保留了光谱信息，但定量分析往往仅提取峰值强度，而非利用完整的光谱轮廓。

因此，关键局限在于传统荧光传感器如何获取和利用光谱信息。大多数系统依赖光学滤光片与标量探测器（如光电倍增管（PMT）或光电二极管（PD））的耦合，在预定义光学带宽内采集的光子被积分为一个标量信号用于定量[19]。从信号处理的角度看，将光谱分布的荧光发射轮廓转换为单一标量值不可避免地减少了可供后续信号处理的光谱信息量。由于分析信号本质上分布在有限的光谱带宽上，保留并处理多通道光谱信息可能为提升信号恢复提供更多机会[20,21]。因此，基于固定标量输出的信号提取策略在补偿随机噪声、探测器差异和基线波动方面可能存在灵活性不足的问题，尤其在低信号水平下更为明显[19,22]。为补偿这种局部光子损失，传统上采用高电子增益将信号提升至噪声之上，但这不可避免地压缩了动态范围并导致高浓度下信号饱和[23,24]。这种内在的硬件增益-范围权衡从根本上限制了传统滤光片系统的分析性能[19,24]。

为克服这一局限，我们提出了一种基于电荷耦合器件（CCD）光谱带积分的荧光检测策略，将固定的硬件定义信号积分转变为发射信号的数字化优化多通道光谱积分。通过获取发射光谱并在优化的光谱窗口内对光子贡献进行数字积分，可从多个光谱通道组合信息来灵活重构分析信号[25,26]。该方法在不单纯依赖电子增益放大的前提下提高了信号提取效率，从而为平衡灵敏度和线性响应范围提供了替代途径。由此，该系统能够在统一的分析框架内同时实现痕量级检测和高浓度定量。该策略广泛适用于具有结构化发射光谱的荧光检测系统，通过数字化优化的光谱信号提取实现荧光定量，而非简单的强度测量。

本研究将该检测方法应用于一款全自动化原位铵态氮分析仪，集成了反向流动注入分析（rFIA）与CCD光谱采集。该系统能够在不同盐度的海水中实现宽浓度范围（0.043 μmol/L至50 μmol/L）的连续监测，并支持长期部署。除该应用外，所提出的框架为改进荧光传感中的信号提取提供了可推广的途径，并为研究海洋氮循环和生物地球化学过程提供了有力工具。

章节摘要

化学原理与光谱表征

铵态氮的测定基于其在碱性条件下与邻苯二甲醛（OPA）和亚硫酸盐反应生成荧光性异吲哚衍生物的过程（图1）。与传统的 mercaptoethanol 法相比，使用亚硫酸盐作为还原剂增强了荧光灵敏度并减少了初级胺和溶解有机质的干扰，如Zhang和Dasgupta所证实[27]。

为确定原位分析仪的最优光学构型，我们

光信号采集的转变：从固定带标量检测到多通道数字光谱积分

本研究的核心分析基础是从传统单通道硬件集成检测转变为基于CCD的多通道数字光谱积分框架。如引言中所述，许多传统荧光传感器采用光学滤光片与标量探测器（如PMT或PD）的耦合，在预定义光谱区域内将荧光信息转换为单一强度值用于定量（图3(a) Way 1）。该方法

结论

本研究开发了一款基于荧光检测和反向流动注入分析的全自动化原位铵态氮分析仪，具有紧凑设计、低试剂消耗（125 μL/样品）和良好的现场适用性。该系统集成了CCD探测器与数字化优化的光谱带积分技术，提高了信号提取的灵活性，实现了宽线性响应范围（0–50 μmol/L），统计检测限为42.6 nmol/L，并具有可靠的定量范围

CRediT作者贡献声明

Hangqian Li：撰写–初稿、可视化、验证、项目管理、方法论、调查研究、资金获取、概念化。Mario Esposito：撰写–审阅与编辑、软件、方法论、概念化。Xu Yao：验证、方法论、调查研究。Sayoni Bhattacharya：验证、调查研究。Ru Wang：验证、调查研究。Eric P. Achterberg：撰写–审阅与编辑、监督、资金获取、概念化。Jian Ma：撰写–

利益冲突声明

作者声明不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争经济利益或个人关系。

致谢

本研究由东海海洋生态中心青年海洋科学基金、自然资源部（项目编号20252005005）、福建省引进高层次人才支持计划（项目编号2026350468）、海洋生态联合研究中心科技发展基金、海洋环境科学国家重点实验室优秀博士奖学金以及厦门大学南强优秀博士计划资助。H.

Hangqian Li|Mario Esposito|Xu Yao|Sayoni Bhattacharya|Ru Wang|Eric P. Achterberg|Jian Ma