中国大鲵（Andrias davidianus）幼体在不同光环境下Clock、Opn5及核心生物钟基因的组织特异性表达与生物信息学解析

《Animals》：Bioinformatic Analysis and Tissue-Specific Expression of Clock Genes and Opn5 in the Chinese Giant Salamander (Andrias davidianus) Under Different Light Conditions

　　

昼夜节律（circadian rhythms）对动物的生理调节和环境适应至关重要。光作为主要外源性同步信号，显著影响昼夜节律系统的维持与重塑。在脊椎动物中，昼夜节律依赖中枢生物钟和外周生物钟的协同作用；然而，两栖动物不同组织对光的分子响应仍缺乏系统研究。本研究中，64只中国大鲵（Andrias davidianus）幼体被随机分为四组：对照组（约12L:12D，5–12 lx，C）、连续中等光组（24L:0D，80 ± 5 lx，I）、连续强光组（24L:0D，220 ± 10 lx，H）和连续黑暗组（0L:24D，0 lx，B）。实验持续13天。研究人员首先利用同源搜索、系统发育分析和保守结构域分析，从转录组来源序列中鉴定候选Clock和Opn5同源物。随后，研究人员使用RT-qPCR（reverse transcription quantitative PCR，实时荧光定量PCR）测量脑、眼和皮肤中Clock、Bmal1、Per2、Cry1和Opn5在不同采样日的表达变化。结果表明，在对照和连续中等光条件下，脑和眼组织中核心生物钟基因的表达变化总体一致，而皮肤呈现相对独立的响应模式。在连续强光条件下，脑和眼表现出不同的时间表达模式，而持续黑暗与皮肤后期转录响应相关。总之，长时间暴露于强光和持续黑暗与中国大鲵幼体脑、眼和皮肤中Opn5及核心生物钟基因的组织特异性和时间依赖性转录响应相关。本研究为两栖动物生物钟基因和非视觉视蛋白（non-visual opsin）对异常光照条件的分子响应提供了基础数据。

研究背景与问题
自然环境中日循环是最稳定的时间线索。生物从蓝细菌到哺乳动物进化出内源性昼夜钟。脊椎动物时间系统主要由转录-翻译反馈环（transcriptional–translational feedback loop，TTFL）驱动：CLOCK和BMAL1形成异源二聚体，结合E-box，激活Per1/2/3和Cry1/2转录；积累的PER-CRY复合物反馈抑制该转录活动。该分子振荡器存在于中枢神经系统和多个外周组织，调节睡眠-觉醒、内分泌、体温和免疫等。核心分子架构保守，但不同物种感知光和同步生物钟的机制分化显著。哺乳动物光同步主要由内在光敏视网膜神经节细胞（intrinsically photosensitive retinal ganglion cells，ipRGCs）经视网膜下丘脑束传至视交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）。硬骨鱼和两栖动物可在眼外组织保留直接光响应，形成更分散的光感受输入。洞穴鱼视蛋白可介导外周钟光检测；离体斑马鱼器官、细胞和早期胚胎可直接响应光；非洲爪蟾（Xenopus laevis）眼、松果体复合体和皮肤表达多种II型视蛋白；爪蟾蝌蚪深脑可在无眼和松果体输入下检测短波长光并传至运动通路。蝾螈中也发现视网膜神经节细胞内在光敏及视锥共表达多种视蛋白。非视觉光受体OPN5（neuropsin）是短波长敏感G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR），参与哺乳动物视网膜和鸟类深脑局部光检测。鱼类Opn5m/Opn5m2有紫外敏感和Gi偶联，表达于视网膜和脑；青鳉垂体促黑素细胞可通过Opn5m直接检测短波长光。持续黑暗改变洞穴鱼非视觉光输入和外周钟同步，但眼外组织仍表达包括Opn5的视蛋白。两栖动物光感受研究长期集中于眼和经典视觉视蛋白，非视觉视蛋白关注较少。中国大鲵（Andrias davidianus）是现存最大两栖动物，保护价值高，已有幼体体色昼夜变化和繁殖个体夜行活动节律报道。人工养殖中不当光照和夜间人工光（artificial light at night，ALAN）可能是持续环境干扰。尽管如此，中国大鲵不同组织是否存在类似光响应分子机制尚不清楚。因此，研究人员比较不同光条件下脑、眼和皮肤中Clock、Bmal1、Per2、Cry1和Opn5随实验天数的表达谱，以表征不同组织对改变光环境的转录响应。

关键技术方法概述
样本来自单一批次约1龄中国大鲵幼体，初始体重4.65 ± 0.20 g，共64只，随机分为C、I、H、B四组，每组16只，三独立实验盆。适应1周后实验13天，于第0、2、4、8、12和13天采集脑、眼和皮肤。研究人员基于先前转录组de novo组装数据，用ORFfinder预测开放阅读框（open reading frame，ORF），BLASTp同源搜索，保守结构域搜索，MAFFT和BMGE比对修剪，MEGA 12构建最大似然树，AlphaFold等预测结构，ProtParam、SignalP 6.0、TMHMM 2.0、WoLF PSORT和cNLS Mapper分析蛋白特征。用RT-qPCR检测表达，Gapdh为参考基因，2^?ΔΔCt法计算相对表达，采用单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）和Tukey多重比较。

研究结果
3.1 核心生物钟基因和候选光受体基因的分子鉴定。基于转录组数据选出6个候选序列。DN2530编码943个氨基酸蛋白，最佳BLASTp匹配为Tiliqua scincoides的CLOCK（identity=80.12%，coverage=89%，E=0）。DN4755虽编码bHLH-PAS结构域蛋白，但最佳匹配为Lissotriton helveticus的PASD1，故排除为Clock或Npas2同源物。DN368、DN11020和DN3015分别与BMAL1、PER2和CRY1高度同一（identity>85%，E=0），注释为候选Bmal1、Per2和Cry1。DN31336编码353个氨基酸蛋白，最佳匹配为Ambystoma mexicanum的OPN5（identity=85.31%，coverage=100%，E=0），含视蛋白典型七次跨膜结构域和保守OPN5/neuropsin特征，注释为候选Opn5。系统发育分析显示DN2530属于CLOCK分支，与NPAS2分支分离；保守结构域数据库（Conserved Domain Database，CDD）注释显示含bHLH-PAS_CLOCK、PAS-A和PAS-B结构域；多序列比对发现6个区分CLOCK与NPAS2的保守位点，DN2530均匹配CLOCK。以RHO为外群的视蛋白家族最大似然树中，DN31336进入OPN5分支，与OPN3、OPN4、RRH和RGR分离；InterPro注释显示其有视紫红质样GPCR七次跨膜结构域及保守OPN5/neuropsin基序。因此，系统发育位置、结构域组成和保守残基支持将DN2530和DN31336分别注释为中国大鲵Clock和Opn5同源物。
3.2 候选蛋白理化性质、定位预测和结构建模。候选蛋白分析显示，CLOCK、BMAL1、PER2和CRY1均无可预测信号肽或跨膜螺旋，GRAVY评分为负；OPN5含七个可预测跨膜螺旋，GRAVY为正，呈典型视蛋白疏水跨膜特征。WoLF PSORT预测CLOCK、BMAL1、PER2和CRY1主要为核蛋白，OPN5主要定位于质膜。前四者各含多个预测核定位信号（nuclear localization signal，NLS），与核内昼夜节律调控功能一致；OPN5也含若干NLS基序，但其七次跨膜拓扑和质膜预测更符合膜结合受体特征，亚细胞定位仍需实验验证。AlphaFold对候选CLOCK核心功能区（第60–420位残基，涵盖bHLH、PAS-A、PAS-B和PAC结构域）建模，显示典型bHLH螺旋-环-螺旋折叠、双PAS-A/PAS-B结构域和短PAC区，空间排布与序列注释边界基本一致，支持DN2530为CLOCK同源物。
3.3 不同光处理下光受体基因和核心钟基因随采样日表达变化。在分析目标基因前，研究人员基于原始Ct值评估参考基因Gapdh在不同组织、光处理和采样日的变异，发现其表达变异有限（CV<5%，SD<1.0 Ct），支持作为参考基因，但因仅评估单一参考基因，解释需谨慎。第0–13天固定采样点中，Opn5、Clock、Bmal1、Per2和Cry1在眼、脑和皮肤表现明显组织特异和处理依赖表达模式。眼：C和I组中Clock、Bmal1和Cry1表达模式大体相似，第2–4天升高，第4天达峰；Per2也早期升高但幅度较小；Opn5在所有处理中总体低表达且相对稳定。H和B组中，Clock、Bmal1、Per2和Cry1的早期升高较C和I组减弱。脑：Opn5时间变化最明显；C、I和H组中Opn5第2–4天升至最高，I组增幅最大；B组中Opn5升高主要在第13天。Clock和Bmal1变化较温和：C和I组主要第2–4天升高，H组第8–12天较高。Per2在多个时点明显波动。Cry1变化较小，仅C和I组检测到早期小幅升高。C和I组基因时间表达趋势相对相似。皮肤：表达模式不同于眼和脑。C和I组中Opn5主要第2–8天升高。H组中多数基因在采样期相对稳定，仅Per2随时间波动较明显。B组中Per2第12–13天升高，Cry1类似晚期升高，Clock和Bmal1变化相对温和。表达模式上，Opn5和Clock相似，均第2天最高；Bmal1、Per2和Cry1表达模式相近。
3.4 不同光处理下各组织相关基因相对表达模式。以第0天为共同基线，Opn5和核心钟基因的倍数变化在时间与幅度上表现组织和处理依赖差异。眼：C和I组中Clock、Bmal1和Cry1相对第0天上调主要集中于第4天；Per2也早期上调，但幅度较小，未超过2倍阈值；Opn5多数时点未达1.5倍上调阈值，若干值低于第0天基线。H和B组中，较少核心钟基因达到2倍上调阈值，仅H组第4天和第13天、B组第8天的Clock达到2倍上调阈值。脑：Opn5相对第0天上调最显著。C、I和H组中Opn5倍数变化最高在第4天，B组最高上调主要在第13天。Clock和Bmal1也呈时间依赖倍数变化：C和I组上调主要第4天，H组较高表达主要第12天。Per2在多个时点达上调阈值，并较长时间保持升高。Cry1倍数变化较小，仅在C和I组显示早期上调。皮肤：C和I组中Opn5第4天达上调阈值。Clock在C组第4天、B组多个时点上调，但在I和H组变化有限。Bmal1总体波动有限，但在B组晚期增加。B组中Per2第13天倍数变化最高，Cry1也在实验后期上调。

讨论总结与结论翻译
4.1 保守Clock转录因子和非视觉光受体。脊椎动物时间调控通常由中枢和外周钟组成的层级系统维持，而非单一中枢振荡器。非视觉光感受也参与环境光的光同步。小鼠Opn5缺失会损害对特定光周期的同步并延迟光周期转换后的再适应；视网膜中紫光可通过OPN5诱导Egr-1等光响应基因，说明OPN5可介导局部光响应。本研究中，同源搜索、系统发育、保守位点比较和结构域分析支持中国大鲵候选Clock和Opn5同源物的序列鉴定。候选Clock具典型bHLH-PAS架构，符合脊椎动物CLOCK转录因子保守结构特征；候选Opn5具典型视蛋白七次跨膜结构，符合OPN5作为非视觉光受体的分子基础。OPN5在脊椎动物中高度保守且组织功能广泛，支持其作为分析环境光输入与组织特异转录响应的候选分子。分子鉴定结果证实中国大鲵存在与Clock和Opn5相关的同源序列，为比较不同采样日和组织表达变化提供序列基础。但基于序列的预测，包括NLS分析，不足以确定OPN5精确亚细胞定位或功能属性，需进一步实验验证。
4.2 脑、眼和皮肤的组织特异性转录响应。C和I组中，眼若干核心钟基因主要在实验早期升高；脑中Opn5在多种光条件下呈明显时间依赖变化；皮肤在持续黑暗下出现显著后期表达增强。这些差异表明中国大鲵不同组织对改变光环境的转录响应并不均一。视网膜含由多种细胞振荡器构成的局部钟网络，可响应光输入进行组织水平昼夜节律调控。非洲爪蟾眼、松果体复合体和皮肤表达多种II型视蛋白，为两栖动物多组织光感受提供直接分子证据；爪蟾蝌蚪深脑也可将光信息直接传至运动输出，支持两栖动物脑组织存在非视觉光响应。需注意，本实验未测不同脑区基因表达，而将整个脑组织作为统一实体分析，观察到的表达模式应解释为整合全脑响应，而非区域脑钟相位关系或同步证据。研究人员也观察到眼和脑某些基因在光-暗循环C组和连续中等光I组显示相似表达模式，但这些比较需谨慎，因为两组同时存在光周期和照度差异。此外，皮肤中各处理组基因表达模式与C组有不同程度分歧。综上，脑、眼和皮肤中Opn5及核心钟基因的不同表达模式支持中国大鲵对改变光环境存在多组织、组织特异性转录响应。同时，本研究仅比较不同实验日固定采样点基因表达，而非连续24小时周期，因此不能确定昼夜节律性、相位、振幅、周期和组织间相位关系；各处理-时间组合生物学重复有限降低统计效力，单一参考基因也增加个体比较不确定性。因此结果主要按跨采样日较广泛的组织和处理相关表达模式解释，而非孤立时点统计显著差异。
4.3 持续强光下脑和眼的分歧转录响应。持续强光下，脑Opn5在实验早期达较高水平，而Clock和Bmal1表达峰出现在中后期。该模式提示持续强光可能与脑钟相关基因时间依赖表达变化相关，但不能推断特定调控通路被激活。小鼠皮肤中OPN5介导局部光依赖钟基因诱导和昼夜光同步；眼组织中OPN5也通过多巴胺相关通路参与光依赖血管发育，说明其功能明显组织依赖。硬骨鱼视网膜中Clock表达与细胞增殖相关基因存在昼夜联系，为局部钟参与视网膜光响应提供跨物种先例。两栖动物研究进一步支持脑和眼可能通过不同局部机制处理光信号：爪蟾蝌蚪尾部间脑区域在无眼和松果体输入下对短波长光直接敏感，光敏区域检测到OPN5阳性和CRY1阳性细胞；两栖动物视网膜本身含多种光响应组件，虎纹钝口螈幼体ON视网膜神经节细胞具内在光敏性，离体爪蟾视网膜光感受器层含局部昼夜振荡器，其相位可被光直接重置。结合这些发现，持续强光下脑Opn5早期升高及Clock和Bmal1后期升高最好解释为时间依赖转录调整；眼早期表达峰减弱和上调时点分散则表明脑和眼对持续强光有不同转录响应。此外，两个连续光处理组I和H第13天无明显基因表达变化，可能因样品在撤光约24小时后采集，此时对光移除的急性转录响应可能已消退。持续强光下脑和眼分歧表达模式表明异常光照可产生组织差异分子效应，但现有数据不足以判断这些效应是否改变组织间功能协调。需注意，C组与连续光组比较反映光周期和照度共同改变，因为C组与I、H组在光-暗循环和照度上均不同；两个连续光组比较可能主要反映相同24L:0D光周期下不同照度相关响应。其他两栖动物研究显示，夜间人工光可影响蝾螈尾再生和摄食，并诱导不同发育阶段氧化应激。人工养殖中，中国大鲵通常饲养于黑暗洞穴，户外生态模拟养殖相对少见。本研究中，连续中等光条件似乎引起更接近对照组的基因响应模式，而连续黑暗组与对照组表达模式不同。研究提出假设：适当光因子可更有效诱导相关基因正常表达。同时必须承认，本实验未评估环境光照光谱特征，LED处理与环境光对照之间的光谱差异可能有助于解释转录响应差异，这些假设需进一步实验验证。目前中国大鲵养殖业信息尚未建立照度、光谱组成或光周期的标准化阈值，因此本研究结果仅提供对改变光照条件响应的分子证据；更全面评估需结合行为、生理和生产指标，才能为确定中国大鲵养殖具体光照参数奠定基础。
4.4 持续黑暗下皮肤后期转录调整。持续黑暗下，皮肤Per2表达在实验后期升高，Cry1呈类似晚期升高，Clock、Bmal1和Opn5变化相对温和。该模式提示长期无光与皮肤后期转录调整相关。非洲爪蟾中环境光可通过II型视蛋白和褪黑素受体调节皮肤色素反应，说明两栖动物皮肤能接收光相关信号。培养皮肤细胞对蓝光显示昼夜和损伤相关响应，非视觉视蛋白在眼外组织中的作用也得到累积证据支持。本研究结果最好解释为持续黑暗下皮肤钟相关基因后期表达变化的证据，而非确认皮肤自主钟功能增强。这些结果须在本实验设计限制内解释：固定时点每日表达比较不能证明皮肤内源性昼夜振荡，也不能建立脑、眼和皮肤间相位耦合。因此，持续黑暗支持皮肤昼夜相关基因和Opn5表达改变，而非外周自主钟功能增强。此外，投喂时间可能是影响生理和转录状态的非光同步线索，未来控制投喂条件的研究可进一步评估其贡献。未来工作应结合完整24小时连续高频采样、蛋白定量和组织定位分析，以评估各组织周期、振幅和相位，以及OPN5与核心钟分子的空间关系；多波长、照度梯度和功能扰动实验可帮助区分眼、脑和皮肤不同光感通路的作用，并将分子变化与行为、生理结果联系。
结论部分可译为：在本研究中，研究人员鉴定了中国大鲵Clock和Opn5的同源序列，并比较了不同光照条件下幼体脑、眼和皮肤中Opn5及核心钟基因随采样日的表达变化。在对照和连续中等光组，脑和眼若干核心钟基因主要在实验早期升高。持续强光减弱了眼早期表达峰，并使脑某些钟基因较高表达向后期转移。持续黑暗与皮肤中Per2和Cry1后期上调相关。这些结果支持中国大鲵幼体对改变光环境表现组织特异性和时间依赖性转录响应，并为研究两栖动物非视觉光感受和优化人工保育光环境提供实验基础。