基于重组蛋白rKDDR-plus的ELISA检测不同临床与血清学谱犬利什曼原虫感染的评价

《Animals》：Evaluation of rKDDR-Plus ELISA in Dogs with Different Clinical and Serological Profiles of Leishmania infantum Infection

大多数感染婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）的犬只保持健康状态，具有低寄生虫载量和阴性至低抗体水平，这使得检测具有挑战性。rKDDR-plus在酶联免疫吸附试验（ELISA）中展现出卓越的诊断性能，但从未在通过体格检查和常规实验室检测全面表征的犬只中进行过测试。本研究旨在评估rKDDR-plus ELISA在不同婴儿利什曼原虫感染状态犬只（n = 94）中的诊断性能，这些犬只被分类为健康血清阴性组（n = 25）、健康血清阳性组（n = 54）和患病组（n = 15）。总共，37只血清阳性犬被归类为低抗体水平组，32只为高抗体水平组。诊断性能在五个组群中进行了评估：（G1）所有犬只，（G2）健康血清阴性+患病（n = 40），（G3）健康血清阴性+健康血清阳性（n = 79），（G4）健康血清阴性+高血清阳性（n = 57），以及（G5）健康血清阴性+低血清阳性（n = 62）。所有组群的阴性符合率（NPA）均为100%，而阳性符合率（PPA）在G2中达到完美（100%），其次是G4（96.88%）、G1（82.61%）、G3（77.78%）和G5（70.27%）。准确度范围为85.14%至100%，受试者工作特征曲线下面积（AUC-ROC）如下：G2（1.000）、G4（0.978）、G1（0.951）、G3（0.937）和G5（0.928）。一致性（kappa值）在G2和G4中几乎完美，其余组群为高度一致。总之，rKDDR-plus ELISA显示出总体良好的诊断性能。

论文解读：基于重组蛋白rKDDR-plus的ELISA检测不同临床与血清学谱犬利什曼原虫感染的评价

一、研究背景与目的

犬利什曼病是由婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）引起的重要人兽共患病。在流行地区，感染犬只的临床表现和免疫状态呈现高度异质性：多数感染犬只无明显临床症状，表现为健康携带状态，其特点是寄生虫载量低、抗体水平低下甚至呈阴性，因此难以被常规检测手段识别。然而，这些健康血清阳性犬只是维持和传播感染的关键宿主，并可能在未来发展为疾病。目前常用的诊断技术各有局限：细胞学或组织学观察无鞭毛体敏感性变异大且依赖专业人员；分子技术如聚合酶链反应（PCR）虽敏感度高，但需要精密设备和昂贵成本；快速免疫层析试纸条作为定性方法，诊断性能不稳定，需定量血清学方法确认。在定量血清学中，酶联免疫吸附试验（ELISA）相较于间接免疫荧光抗体试验（IFAT）对健康血清阳性犬的检出更敏感，但传统全抗原或可溶性提取物仍存在交叉反应等问题。为此，开发新型重组蛋白以提高诊断特异性与敏感性成为重要方向。rKDDR-plus是一种来源于婴儿利什曼原虫驱动蛋白的重组蛋白，由39个氨基酸串联重复15.3次构成，理论上富含原虫B细胞表位。此前该蛋白已在人类内脏利什曼病患者、猫和犬样本中测试，但犬只仅依据体格检查分为有症状和无症状，未结合血液和尿液常规实验室检查及抗体水平进行综合分层。因此，本研究旨在评估rKDDR-plus ELISA在依据体格检查、血尿常规实验室检查和抗体水平分层的不同感染状态犬只中的诊断性能，并与参考血清学方法（婴儿利什曼原虫全抗原包被ELISA）进行一致性评价。

二、研究方法概述

研究人员收集了来自西班牙不同地区的94份犬残留血清样本，时间跨度为2020年至2022年5月。所有犬只均经过全面的体格检查、血常规、血清生化、尿常规及尿蛋白肌酐比检测，并通过内部建立的婴儿利什曼原虫全抗原包被ELISA测定抗体水平，据此将犬只分为三组：健康血清阴性组（n=25）、健康血清阳性组（n=54）和患病组（n=15）。其中，69份血清阳性样本进一步按抗体水平分为低血清阳性组（<150 EU，n=37）和高血清阳性组（≥150 EU，n=32）。rKDDR-plus ELISA采用100 ng/mL的rKDDR-plus蛋白包被板，血清样本1:100稀释，以抗犬IgG辣根过氧化物酶为二抗，通过计算反应指数（RI）判定阴阳性（RI>1.000为阳性）。诊断性能评估在五个组群中进行：G1（所有犬只）、G2（健康血清阴性+患病）、G3（健康血清阴性+健康血清阳性）、G4（健康血清阴性+高血清阳性）、G5（健康血清阴性+低血清阳性）。统计指标包括阳性符合率（PPA）、阴性符合率（NPA）、准确度、受试者工作特征曲线下面积（AUC-ROC）、约登指数、kappa一致性系数，并根据西班牙流行区5%-50%的血清阳性率情景计算阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）。

三、研究结果

3.1 临床与血清学数据

健康血清阴性犬的rKDDR-plus ELISA反应指数（RI）值均低于预设临界值，而健康血清阳性和患病犬的RI值分布较广，大部分高于临界值。抗体水平（低/高）与临床状况（健康血清阳性/患病）之间无显著关联（Fisher精确检验：p=0.572）。利什曼病分期（LeishVet I期/IIa期）与抗体水平也无显著关联（p=0.282）。终点ELISA单位（EU）的中位数在健康血清阴性犬（16.6 EU）显著低于健康血清阳性犬（176.1 EU）和患病犬（202.7 EU）（p<0.001），但健康血清阳性与患病犬之间无显著差异（p=1）。值得注意的是，混种犬中rKDDR-plus ELISA阳性比例（78.8%）显著高于纯种犬（54.2%）（p=0.023），而全抗原ELISA也显示类似趋势但未达统计学意义。

3.2 rKDDR-plus ELISA的诊断性能

在G2组（健康血清阴性+患病）中，PPA达到100%，而在其他组群中依次下降：G4（96.88%）、G1（82.61%）、G3（77.78%）、G5（70.27%）。所有组群的NPA均为100%。约登指数排序为：G2（1）、G4（0.97）、G1（0.83）、G3（0.78）、G5（0.70）。kappa一致性在G2和G4中为几乎完美（分别为1和0.965），其余组群为高度一致（G1 0.716、G3 0.689、G5 0.656）。由于无假阳性结果，PPV在所有血清阳性率情景下均为100%。NPV在G2组中始终为100%，在G5组50%血清阳性率时最低（77.08%）。准确度在G2组为100%，在G5组50%血清阳性率时降至85.14%。ROC分析显示，所有组群的AUC值均表明高诊断准确性：G2（1.000）、G4（0.978）、G1（0.951）、G3（0.937）、G5（0.928）。

四、讨论与结论

本研究表明，rKDDR-plus ELISA在高血清阳性犬和健康血清阴性犬中表现尤为可靠，与参考ELISA的一致性接近完美，AUC-ROC高达0.978，证实了其稳健性。但在健康血清阳性和低血清阳性犬中诊断性能下降，这与此类犬只通常抗体水平低下的特点一致。原因在于rKDDR-plus作为重组蛋白仅包含特定免疫优势表位，而非完整抗原谱，因此针对其他抗原产生的抗体（尤其低水平时）可能无法被检出。PPV在所有情景下均为100%，反映其极佳的特异性；NPV则因血清阳性率和临床血清学谱而异，在低抗体水平群体中较低。与既往研究相比，本研究的PPA（82.6%）低于Siqueira等（2021）报道的96.7%和97.2%，这可能源于本研究犬只经过更全面的临床实验室分层，反映了实际临床中的异质性。NPA（100%）与既往研究高度一致，确认其作为确证工具的价值。研究局限性包括：患病犬数量少（n=15）且仅涵盖LeishVet I-IIa期，可能低估了重症犬的抗体差异；感染未经寄生虫学或分子方法确认；阴性对照血清来自巴西而非西班牙本土，可能影响临界值的代表性。结论：rKDDR-plus ELISA是一种可靠且特异的血清学工具，尤其适用于高血清阳性犬的抗体检测，并能准确排除血清阴性动物。但其在健康血清阳性和低抗体水平犬中的检测能力有限。将rKDDR-plus ELISA与分子或其他血清学方法联合应用，有望进一步提升诊断准确性，拓展其在临床和流行病学研究中的应用。