基于质谱成像（MSI）解析铜绿假单胞菌在PDMS与肺外植体生物膜中生物分子的空间分布

《Biofilm》：Exploring the spatial distribution of biomolecules in Pseudomonas aeruginosa biofilms formed on PDMS and lung explants by mass spectrometry imaging

采用质谱成像（MSI）探究铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在聚二甲基硅氧烷（PDMS）和肺外植体上形成的生物膜中生物分子的空间分布。优化了两种用于质谱成像（MSI）的定制生物膜模型。绘制了铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜内分子分布。绿脓菌素（pyocyanin）深度渗透至肺组织。

研究背景与问题：细菌生物膜（biofilm）是微生物在胞外基质中形成的适应性组织结构，基质含多糖、蛋白和胞外DNA，使细胞在自然、工业或临床不利环境中持续存在。生物膜内细胞对抗菌剂和宿主免疫防御耐受性增强，导致感染慢性化，并在医疗器械相关感染和感染组织中发挥重要作用。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是重要机会致病菌和生物膜模型，可引起医院感染，尤其在囊性纤维化患者中定植呼吸道并形成耐药生物膜。肺部生物膜促进细菌保护、通过群体感应（quorum sensing, QS）进行细胞间通讯并调节宿主免疫。然而生物膜结构化学异质性高，内部微环境导致细菌亚群生理异质，传统分析方法难以捕捉。质谱成像（mass spectrometry imaging, MSI）无需标记即可直接映射代谢物、脂质和肽的空间分布，基质辅助激光解吸/电离质谱成像（matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI-MSI）、溶剂束电离质谱成像（DESI-MSI）和二次离子质谱（SIMS）等可提供空间化学信息。但生物膜脆弱且分子异质，样品制备关键，包埋介质影响离子化效率和离子竞争。既往MSI多研究琼脂上菌落，只能部分反映表面相关生物膜；兼容MSI且保留结构的生物膜模型有限，尤其用于宿主-生物膜互作。合成表面聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）可模拟生物材料-细菌界面，肺外植体提供更生理的离体环境。因此，研究人员旨在表征并比较PDMS和肺外植体上生长的P. aeruginosa生物膜，通过MSI揭示适应不同环境的分子特征，理解组织定植机制。

研究人员开展的研究：研究人员在两类底物上开发并优化生物膜培养、切片和包埋；在PDMS上接种PAO1-eGFP或PA14，在穆勒-欣顿培养基（Mueller Hinton, MH）或人工痰液培养基（artificial sputum medium, ASM）中培养；肺外植体接种PAO1-eGFP并用ASM培养；随后用MALDI-MSI映射关键代谢物。研究得出，两模型虽条件不同但代谢谱高度重叠，检测到QS分子、吩嗪类和鼠李糖脂，pyocyanin深度渗透肺组织。该方法有助于理解生物膜-表面和生物膜-组织互作，为同时研究生物膜组织、代谢活性和宿主-病原互作提供工具。

关键技术与方法：建立PAO1-eGFP和PA14的P. aeruginosa生物膜，分别生长于PDMS和10–12周龄健康小鼠新鲜尸体肺外植体，并比较MH与ASM培养基；评估最佳切割温度包埋剂（Optimal Cutting Temperature compound, OCT）、琼脂、明胶和羧甲基纤维素（carboxymethyl cellulose, CMC）的MSI兼容性，选择明胶包埋，冷冻切片并优化切割平面以增加生物膜暴露面积；以2,5-二羟基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid, DHB）为基质，采用AP-SMALDI5高分辨MALDI成像离子源耦合Q Exactive Plus Orbitrap正离子模式采集，SCiLS处理数据，METASPACE和MS/MS注释代谢物，并用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, H&E）和免疫荧光验证组织结构和细菌侵入。

研究结果：
3.1 明胶在MSI分析中产生最低水平干扰离子。研究人员比较OCT、琼脂、明胶和CMC在m/z 100–1500范围的信号干扰。OCT产生大量聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）相关峰；琼脂产生强干扰且包埋性能差；明胶和CMC干扰离子较少且信号抑制有限。在肺切片中，以5种内标评估肺-包埋介质界面，明胶与CMC内标相对丰度相当，无显著离子强度差异；但明胶中最强干扰离子强度约为CMC中对应离子的三分之一。H&E显示明胶包埋后肺组织与包埋介质界面保存良好。因此选择明胶作为后续包埋介质。

3.2 培养条件和切片策略优化提高生物膜表面积。研究人员在PDMS上比较PAO1-eGFP和PA14在MH/ASM中的生物膜厚度。ASM培养的生物膜比MH厚，平均约77 μm，增加约30%；两菌株在ASM中平均厚度相似，PA14更均一。由于5 μm MALDI激光分辨率下80 μm厚生物膜仅约16像素，研究人员改变切割方向，优化切片平面使暴露生物膜表面积加倍，长度超过300 μm，显著增加可分析像素。

3.3 P. aeruginosa在离体条件下侵入并降解呼吸道上皮。肺外植体经PAO1-eGFP ASM感染24 h。H&E显示感染后肺表面细胞损伤，细胞结构逐步破坏和核结构丢失，形成损伤与健康细胞界面。免疫荧光结合抗P. aeruginosa抗体、肌动蛋白和DAPI显示肺表面存在PAO1-eGFP生物膜；感染组织肌动蛋白染色明显丢失或弥散，DAPI蓝光虽检测到但无清晰核结构，细菌也出现在肺外植体深层，显示P. aeruginosa侵入能力。

3.4 MALDI-MSI揭示生物膜内代谢物分布。非靶向MALDI-MSI分析中质量测量误差低于3 ppm，并在信号允许时进行MS/MS。m/z 718.5388（[C₃₉H₇₆NO₈P + H]⁺）被分配为磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine, PE），优先分布于P. aeruginosa体外生物膜并用于定位组织切片中细菌生物量；m/z 760.5851（[C₄₂H₈₂NO₈P + H]⁺）被分配为磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine, PC），主要见于真核细胞和肺组织，感染区信号降低。代谢物主要归为QS分子、吩嗪类和鼠李糖脂。QS网络中，m/z 260.1645被推定分配为Pseudomonas quinolone signal（PQS）或2-heptyl-4-hydroxyquinoline-N-oxide（HQNO）同分异构体，倾向深部生物膜层并在离体模型深部组织也可检出；2-heptyl-4-quinolone（HHQ）m/z 244.1694经MS/MS与标准谱匹配（注释水平2）分布较广；未检测到HSL，符合成熟生物膜中PQS信号占优势。NQNO等AQNO与PQS/HQNO空间共定位。吩嗪类中pyocyanin在m/z 211.0860经MS/MS与标准谱匹配（注释水平2），在PDMS模型中倾向深部层和PDMS界面；在肺外植体模型中广泛深入肺组织。基质匹配标准点样验证PQS、HHQ和pyocyanin可在离体模型条件下有效离子化并显示特异性空间信号；HQNO在该浓度和条件下肺组织中检测较差。鼠李糖脂m/z 527.3186被推定为单鼠李糖脂C₁₀-C₁₀同系物，两个模型均检出，倾向定位于细菌群落与环境界面，但重复间变异较大。总体上，QS、吩嗪和鼠李糖脂共同构成协调网络，支持生物膜持续、适应和宿主定植中的毒力。

讨论部分总结：讨论强调研究人员开发的两类模型互补，PDMS模拟医疗器械等生物材料界面，肺外植体提供更生理的组织环境。明胶因干扰最低且组织保存良好而被选用，优化切片增加采集面积。两模型条件不同但代谢物谱高度重叠，表明生物膜具有保守分子特征。PC在感染区减少与P. aeruginosa磷脂酶水解宿主脂质及胆碱代谢物利用相关，但成像数据不能区分直接利用、宿主脂质重塑或其他过程。PQS/HQNO因信号强度低未能通过MS/MS区分；HHQ作为共同前体分布广泛。pyocyanin在PDMS模型倾向基底部高细胞密度和潜在低氧区域，在肺组织深渗透，研究人员指出现有数据不足以建立pyocyanin分布与细胞损伤的直接联系。模型可改造用于突变株、不同培养时间和时间序列MSI，以研究生物膜形成动力学和宿主-病原互作。

研究结论（翻译）：研究人员开发了两种创新模型，以模拟不同慢性生物膜感染情况。原始横截面设计允许同时研究生物膜所有层，从而可视化分子在生物膜内的均匀或异质分布。这些模型易于修改，因此可适应不同菌株、培养基、孵育时间、支持物等。特别地，纳入生物膜相关突变株或开展生物膜发育过程中的时间序列MSI分析，可为生物膜形成动力学和宿主-病原体互作提供进一步见解。将这些模型与为它们开发和优化的MSI耦合，尽管实验条件不同，仍揭示两类生物膜的保守分子谱。总体而言，本研究中观察到的代谢物空间分布突出P. aeruginosa生物膜高度组织化的代谢架构。QS分子作为全局调节因子协调细菌通讯并控制毒力因子表达。吩嗪类，包括pyocyanin，建立氧化还原活性环境，支持氧限制条件下的细菌代谢，同时促进周围组织氧化应激。鼠李糖脂参与生物膜基质结构和动力学，促进表面定植和生物膜扩展。这些代谢物并非独立作用，而是形成相互连接的调控和代谢网络，使生物膜能够持续存在、适应环境约束并与宿主组织互作。pyocyanin在肺外植体模型中的显著存在和扩散进一步说明，主要参与生物膜生理的分子也可能在感染过程中直接导致宿主损伤。通过保留空间信息，MALDI-MSI为同时研究生物膜组织、代谢活性和宿主-病原体互作提供了强大方法。