组蛋白乳酸化上调CEBPB的转录活性，从而激活CXCL12和p21，进而调控血管平滑肌细胞的衰老过程及巨噬细胞的极化状态

《Cellular Signalling》：Histone lactylation-upregulated CEBPB transcriptionally activates CXCL12 and p21 to modulate vascular smooth muscle cell senescence and macrophage polarization

　　摘要

背景
腹主动脉瘤（AAA）是一种普遍的血管疾病，其死亡率非常高。血管平滑肌细胞（VSMCs）的表型转换是这种疾病进展过程中的一个关键病理特征。最近的研究表明，代谢重编程，特别是乳酸积累，在调节心血管疾病中的细胞过程中起着重要作用。然而，乳酸影响VSMCs功能障碍的机制尚未完全阐明。

方法
通过用血管紧张素II（AngII）处理VSMCs，建立了一个AngII诱导的VSMC损伤模型。使用比色法测量乳酸的产生量。通过荧光测定法分析氧气消耗率（OCR）。使用Seahorse XF糖酵解应激测试试剂盒分析细胞外酸化率（ECAR）。通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）量化mRNA水平，并通过Western blotting评估蛋白质表达。通过流式细胞术测量活性氧（ROS）水平。使用流式细胞术和TUNEL测定法评估细胞凋亡。为了检测衰老细胞的存在，采用了SA-β-gal染色和免疫荧光测定法。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）量化白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的水平。通过染色质免疫沉淀（ChIP）和双荧光素报告基因测定法研究组蛋白H3第18位赖氨酸（H3K18la）的乳酸化、CCAAT增强子结合蛋白β（CEBPB）与目标基因（CXCL12、p21、CDKN1A）之间的相互作用。

结果
在AAA患者组织和AngII处理的VSMCs中，p21和CXCL12的mRNA和蛋白质水平显著上调。沉默p21或CXCL12可以减弱AngII诱导的VSMC凋亡。AngII处理增加了ROS的产生、SA-β-gal阳性细胞、与衰老相关的P16表达和SASP因子（IL-6、CCL2、MMP2、CCL7），这些现象可以通过2-DG处理或p21敲低得到逆转。AngII还促进了促炎细胞因子的分泌，这种作用可以通过2-DG处理或CXCL12沉默得到缓解。CXCL12敲低进一步减少了AngII诱导的M1巨噬细胞极化并抑制了M2极化。AAA组织和AngII处理的VSMCs中H3K18的乳酸化水平升高。乳酸处理增加了VSMCs中的CXCL12、p21和CEBPB表达以及H3K18的乳酸化水平。ChIP测定显示H3K18la在CEBPB基因的启动子区域富集，从而上调其表达。上调的CEBPB直接结合到CXCL12和p21的启动子上，增强了它们的转录，而这种结合在乳酸处理下进一步增强。此外，过表达p21或CXCL12可以恢复CEBPB敲低的效果。

结论
在AngII诱导的VSMC损伤模型中，组蛋白乳酸化在转录上激活了CXCL12和p21，导致VSMC的衰老、炎症和巨噬细胞极化。结合人类AAA组织的相关发现，这些结果确定了乳酸-CEBPB-CXCL12/p21轴可能是AAA形成和进展的一个候选机制，需要在体内动脉瘤模型中进行验证。

引言
腹主动脉瘤（AAA）是一种常见的血管疾病，主要由衰老和损伤等因素引起，导致主动脉壁弹性降低，从而引起局部持续扩张[1]。主动脉瘤破裂具有很高的死亡风险，高达80%[2]。AAA的进展通常涉及复杂的生物过程，包括慢性炎症、血管平滑肌重塑、细胞凋亡和细胞外基质（ECM）降解[3],[4]。目前AAA的主要治疗策略包括开放性手术修复和血管内修复[1]。然而，目前还没有FDA批准的医疗干预措施可以有效限制疾病进展或降低破裂风险，这突显了改进预防和早期检测的迫切需求。深入理解驱动AAA进展的分子机制至关重要，因为这些知识对于发现创新的治疗靶点至关重要[5]。
作为一种典型的退行性主动脉疾病，AAA与细胞衰老密切相关[6],[7]。细胞衰老的特点是细胞周期不可逆停止，由各种内部和外部因素以及发育信号触发[8]。在体内条件下，衰老通常由氧化应激、紫外线暴露或化学物质引起的DNA损伤引发，这些因素会破坏基因组稳定性。p53/p21通路是这一机制中的一个关键调节因子，其中p21作为Cip/Kip家族中的周期依赖性激酶（CDK）抑制剂，起着重要作用[9]。尽管衰老细胞仍能维持存活，但它们的代谢谱发生了显著变化，伴随着基因表达的广泛改变，共同产生多方面的衰老相关分泌表型（SASP）。SASP包括各种促炎介质、生长因子、趋化因子和基质重塑酶，它们都在组织内发挥重要的自分泌和旁分泌作用[10]。最近的研究表明，线粒体功能障碍是诱导衰老的主要因素，导致衰老肿瘤细胞中糖酵解和乳酸积累增加[11],[12]。

近年来，组蛋白乳酸化引起了广泛关注。它直接反映了细胞内的乳酸水平和糖酵解代谢活动的强度。这种修饰与细胞能量代谢状态密切相关，作为分子密码，在染色质水平上将代谢信号转化为基因调控指令，从而提出了一种将细胞代谢与表观遗传调控联系起来的新机制[13]。据报道，组蛋白H3K18位置的乳酸化可以标记组织特异性的激活子，从而促进下游基因的表达[14]。
我们的初步实验结果发现，在AAA患者中，各种类型的主动脉细胞存在广泛的线粒体功能障碍，同时VSMCs内的乳酸含量显著增加，表明这些VSMCs中可能发生了衰老过程。随后，差异表达基因（DEGs）的分析显示衰老标志物p21显著上调[15],[16]。CXCL12是一种在真皮成纤维细胞中高度表达的趋化因子，主要通过CXCR4和ACKR3进行信号传导[17]。最近的研究表明，特异性阻断CXCL12/CXCR4轴可以显著抑制腹主动脉的持续扩张和破裂，减少炎症细胞在主动脉壁中的浸润，并抑制收缩型VSMCs向巨噬细胞样状态的表型转变[18]。与此研究结果一致，最近的研究表明，抑制CXCL12/CXCR4信号传导可以显著减少患有肺动脉高压（PH）的大鼠肺血管中的周细胞覆盖率和巨噬细胞浸润[19]。这一观察表明，针对这一轴的治疗可能代表治疗主动脉病变的一种有前景的新方法。
因此，本研究提出以下假设：血管衰老微环境驱动VSMCs的能量代谢向有氧糖酵解转变，导致乳酸产生。积累的乳酸诱导组蛋白乳酸化，从而上调特定转录因子的表达。这反过来激活下游靶标的转录，包括CXCL12和p21，从而促进与AAA相关的VSMC损伤表型。重要的是，由于本研究采用了体外AngII诱导的VSMC损伤模型，因此这些发现应被视为VSMCs对动脉瘤相关压力的自主反应，而不是AAA发病机制的直接证据；需要在体内进行验证。通过一系列测定，本研究验证了这一假设，并进一步确定了未来研究与AAA相关的VSMC功能障碍的候选治疗靶点。

临床样本
本研究招募了30名被诊断为AAA的个体。此外，还包括30名计划进行冠状动脉旁路移植（CABG）等手术的患者，这些手术涉及获取外周血管。根据术前评估，这些对照组成员没有主动脉扩张或既往血管疾病的迹象。在手术过程中，从这些对照患者中获取了桡动脉标本，作为正常对照。

单细胞测序用于分析AAA患者主动脉的细胞群体和代谢途径
为了表征人类AAA组织的细胞组成和代谢特征，研究人员首先对一个公开的单细胞RNA测序数据集（GSE166676）进行了描述性分析，该数据集包括AAA患者和正常对照者的主动脉组织。虽然其他细胞类型，如内皮细胞、巨噬细胞和淋巴细胞也参与AAA的发生，但VSMCs的功能障碍在破坏结构完整性方面起着关键作用。

讨论
VSMCs是动脉中层的主要成分，对于维持正常的血管生理功能至关重要。它们的基本功能包括调节血管张力、血流和血压，以及协调血管壁的生物合成、增殖和收缩。普遍认为，VSMCs的功能障碍是AAA发展的主要驱动因素，这一点是机制研究的核心[21]。

作者贡献声明
Han Yongxin：撰写——原始草案，验证，项目管理，方法学，数据管理，概念化。
Wang Jiacheng：方法学，研究，正式分析，数据管理。
Li Ruchen：验证，方法学，研究，正式分析。
Shi Xin：监督，资源管理，研究。
Zhou Hua：验证，资源管理，项目管理，研究。
Wang Mo：软件，项目管理，研究，数据管理。
Wu Xuejun：资源管理，研究，数据。

发表同意
不适用。

伦理批准和参与同意
本研究严格遵循《赫尔辛基宣言》的相关规定和要求。所有参与者均已获得书面知情同意，该研究得到了山东第一医科大学附属山东省医院的伦理委员会的批准。

伦理声明
所有参与者或其法定代表均已获得参与研究和发表文章的书面知情同意。参与者的隐私权得到了保护。
本研究包括器官或组织捐赠者。本研究使用了人类生物材料，已获得捐赠者或其亲属或法定代表的同意，用于本研究及文章的发表。

资助
本研究得到了中国山东省自然科学基金青年项目（ZR2022QH390）的支持。

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢
无。