红点石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV）非结构蛋白B1/B2突变株的构建及其在感染过程中的动态变化

《Fish & Shellfish Immunology》：Construction of red-spotted grouper nervous necrosis virus (RGNNV) nonstructural protein B1/B2 mutant strains and dynamics during infection

　　

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  建立了一种基于质粒的逆向遗传学系统用于RGNNV的研究。
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  成功挽救并表征了具有B1/B2突变的六种重组病毒。
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  体外分析显示，重组病毒的感染力与野生型病毒相当。
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  体内实验表明，这些重组病毒的致病性基本相当，除了B2QM突变体表现出死亡时间延迟。
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  突变回复恢复了B1/B2蛋白的表达，为NNV的致病机制提供了见解。

引言

神经坏死病毒（NNV）是一种单链正链RNA病毒，属于Nodaviridae科Betanodavirus属[1]。NNV的无包膜二十面体病毒颗粒直径约为25–35纳米，由一个包裹内部核心的衣壳组成，核心包含两段RNA。RNA1编码病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp，也称为蛋白A），而RNA2编码唯一的结构蛋白——衣壳蛋白（CP）[2]。当病毒RNA复制时，从RNA1的3’末端合成亚基因组RNA3[3]。RNA3编码非结构蛋白B1和B2，在成熟病毒颗粒中不存在，但在感染期间出现[4]。根据RNA2的T4区域，NNV可分为四种主要基因型：红斑石斑鱼NNV（RGNNV）、鳍足鲆NNV（BFNNV）、虎河豚NNV（TPNNV）和条纹杰克NNV（SJNNV）[5]，以及普遍认可的第五种基因型——比目鱼nodavirus（TNV）[6]。与其他具有有限生态位的病原体群体不同，RGNNV因其全球传播和异常广泛的宿主范围而表现出最高的毒力[2]。

B1蛋白（111个氨基酸，约11 kDa）与RdRp具有相同的开放阅读框（ORF），而B2蛋白（75个氨基酸，约8 kDa）与RdRp存在“+1”密码子偏移。这两种早期表达的病毒蛋白在病毒复制周期中执行不同的功能：B1蛋白通过两个富含精氨酸的核定位域定位于细胞核，并抑制宿主的干扰素反应，从而促进RGNNV的感染[7],[8]。早期研究还发现，过表达的B1蛋白通过降低线粒体膜电位损失具有抗坏死细胞死亡的作用[9]。目前关于B1蛋白的研究仍然很少。B2蛋白通过dsRNA隔离机制强烈抑制RNA沉默[10],[11],[12]，同时通过特定信号破坏线粒体功能[13]。这种线粒体定位抑制了复合体II的活性，并诱导H₂O₂介导的Drp1活化，最终通过Bax上调触发非坏死性凋亡[14]。此外，B2蛋白还调控RNA聚合酶II的表达，干扰宿主干扰素反应，进一步促进病毒的持续存在[15]。

为了进一步研究B1和B2蛋白在病毒感染中的作用，使用逆向遗传系统直接将遗传修饰引入病毒基因组。逆向遗传系统通过故意操纵核苷酸序列来研究基因，以解码分子调控机制[16]。病毒核苷酸序列被引入细胞，并利用宿主的翻译机制表达病毒蛋白，随后形成具有感染性的病毒颗粒。这一过程被称为“病毒拯救”。由于病毒之间的基因组异质性较大，不同病毒物种的逆向遗传系统具有不同的配置。

作为一种正链RNA病毒，nodavirus可以直接利用宿主的翻译系统从其基因组cDNA中表达蛋白。Alphanodavirus是一类昆虫特异性病毒，与betanodavirus一起构成Nodaviridae科。Alphanodavirus的逆向遗传系统已在Flock house病毒（FHV）、Pariacoto病毒（PaV）和Nodamura病毒（NoV）中建立[17],[18],[19]。从转染了初级cDNA克隆的各种培养细胞中有效回收了具有感染性的病毒颗粒。在开发NNV的逆向遗传系统过程中，首先成功地从SJNNV中恢复了具有感染性的病毒颗粒[20]。通过将体外转录产生的全长RNA1和RNA2转录本引入鱼细胞系，证明了病毒的复制和增殖。随后，在2008年，研究人员使用T7启动子成功恢复了RGNNV[21]。相比之下，逆向遗传方法在NNV研究中的应用较少。

越来越多的证据表明，非结构蛋白和辅助基因在病毒致病性中起关键作用。针对病毒出血性败血症病毒（VHSV）非结构蛋白的定点突变改变了其致病性[22]，而组合删除传染性支气管炎冠状病毒（IBV）的辅助基因3b/5a/5b降低了病毒的适应性[23]。在这项研究中，尽管使用了原核或真核表达系统，但仍然建立了一种用于RGNNV的逆向遗传系统，以基因操纵病毒基因组中的非结构蛋白B1和B2，并挽救了相应的重组病毒。随后在体外和体内评估了这些病毒的感染性、复制特性和致病性，以研究B1和B2蛋白在NNV感染和致病性中的作用。

小节片段

野生型病毒、细胞和动物

野生型RGNNV（CNPgg2108株）[24]在条纹蛇头鱼（SSN-1）细胞和石斑鱼鳍（GF-1）细胞中培养。培养上清液被收集，直到观察到明显的完全细胞病变效应（CPE）。混合物经过3次冻融处理，然后以12000×g、4°C的条件离心10分钟，使用0.22 μm过滤器（Merck Millipore, USA）过滤，存储在-80°C以备后续实验使用。GF-1细胞用于通过Reed和Muench方法测定病毒滴度。

SSN-1

RGNNV逆向遗传系统的构建

为了研究非结构蛋白B1和B2的作用，使用本研究中建立的逆向遗传系统生成了RGNNV重组突变体。图1B展示了旨在保留RdRp功能同时靶向B1和B2的定点突变策略。由于B1的起始密码子位于B2之前，因此引入点突变生成了pcDNA3.1-Hdz-T7-B1QM，将甲硫氨酸（Met）替换为丙氨酸（Ala）。

讨论

逆向遗传已成为研究病毒机制的成熟技术，并被广泛应用于感染多种宿主物种的病毒研究中，尤其是通过基于传染性cDNA克隆的系统。在这项研究中，建立了一种高效的逆向遗传系统用于拯救betanodavirus RGNNV，并成功恢复了在体外和体内都具有感染性的病毒颗粒。在开发NNV逆向遗传系统时，Iwamoto等人[20]首次

伦理声明

本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。该研究获得了中国海洋大学的批准。

CRediT作者贡献声明

张玉琦：撰写——原始草稿、验证、数据管理。邢静：撰写——审稿与编辑、资金获取、数据管理、概念构建。汤晓倩、崔昌：监督、方法学。盛秀珍：监督、方法学。池恒：监督、方法学。詹文斌：监督、方法学。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数据可用性

数据可应要求提供。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（2023YFD2400702、2018YFD0900503）和国家自然科学基金（32173005）的支持。

张玉琦|汤晓倩|盛秀珍|池恒|崔昌|邢静|詹文斌