《Food and Chemical Toxicology》：5-Hydroxymethylfurfural induces skeletal toxicity associated with ROS accumulation by disrupting cartilage and bone remodeling in zebrafish larvae
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摘要5-羟甲基糠醛（5-HMF）是高糖食物和部分药品中受热产生的美拉德反应产物。尽管已知5-HMF与细胞毒性、遗传毒性和发育毒性相关，但其对骨骼发育和骨吸收细胞的影响尚未得到充分阐明。本研究探讨了5-HMF是否破坏斑马鱼幼鱼的骨骼发育以及活性氧（ROS）是否参与其中。野生型斑
摘要
5-羟甲基糠醛（5-HMF）是高糖食物和部分药品中受热产生的美拉德反应产物。尽管已知5-HMF与细胞毒性、遗传毒性和发育毒性相关，但其对骨骼发育和骨吸收细胞的影响尚未得到充分阐明。本研究探讨了5-HMF是否破坏斑马鱼幼鱼的骨骼发育以及活性氧（ROS）是否参与其中。野生型斑马鱼和Tg(sox9b:GFP)及Tg(sp7:EGFP)报告线路被暴露于受精后8小时至10、25或50 μg/mL的5-HMF中。通过天蓝色染色、茜素红染色、荧光成像、TRAP染色和RT-qPCR评估软骨、矿化骨、成骨细胞、类破骨细胞、ROS生成和骨骼基因表达。5-HMF降低了颅面软骨发育，导致软骨细胞形态异常，减少了颅面矿化和成骨细胞报告信号，并增加了TRAP阳性的类破骨细胞活性。这些表型伴随ROS积累增加、sod1、sod2和cat表达降低、软骨发生和成骨标记物表达受抑制，以及与基质降解和破骨细胞分化相关的标记物升高。与ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸联合处理部分恢复了软骨形态、骨矿化和成骨细胞报告信号，同时降低了TRAP染色。这些发现表明，高浓度5-HMF通过破坏骨形成与骨吸收之间的平衡，诱导斑马鱼幼鱼ROS相关的骨骼毒性。这些结果为高暴露条件下的骨骼毒性提供了机制性证据，并支持在相关暴露水平下进一步评估。
引言
5-羟甲基糠醛（5-HMF）是一种呋喃醛，主要由己糖的酸催化脱水产生，也是美拉德反应的中间产物或终产物。它广泛存在于热加工食品中，包括蜂蜜、焦糖制品、干果、烘焙食品和婴幼儿食品，也与含糖药品制剂的质量控制相关[1], [2], [3], [4]。由于5-HMF化学活性强，可进一步转化为其他产物，其含量被广泛用作高糖基质中热加工、储存和质量劣变的指标[2], [3], [4]。
毒理学研究已将5-HMF暴露与氧化应激、上皮损伤、发育毒性、遗传毒性、炎症反应和器官特异性损伤联系起来[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]。近期研究进一步表明，5-HMF可干扰斑马鱼的抗氧化系统、损害胃上皮屏障功能、在果蝇中诱导发育毒性、通过活性氧（ROS）相关信号通路破坏斑马鱼心血管发育，并促进小鼠中与氧化应激和凋亡相关的生殖毒性[5], [6], [7], [8], [9], [10]。这些研究表明氧化应激是5-HMF毒性的重要组成部分。我们此前报告高浓度5-HMF在斑马鱼幼鱼中诱导发育毒性、损害软骨发育并降低骨矿化[11]，并在相同浓度范围内进一步证实了ROS-Wnt相关的心血管发育毒性[15]。然而，骨骼表型的细胞基础，特别是软骨细胞、成骨相关骨形成和类破骨细胞骨吸收的协调反应，尚未得到充分理解。
斑马鱼（Danio rerio）因胚胎和幼鱼体外发育、光学透明且可进行高效的活体成像，而被广泛应用于发育生物学、毒理学、遗传研究和化学筛选中[16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23]。斑马鱼骨骼在细胞和分子特征上与哺乳动物骨骼高度相似，标记软骨或成骨细胞的报告线路为研究骨骼形态发生和化学诱导的骨骼毒性提供了有用工具[22], [23], [24]。斑马鱼模型已被应用于研究糖皮质激素诱导的骨骼损伤和骨病机制，支持其用于评估毒物诱导的骨骼表型的适用性[25], [26]。
在本研究中，野生型斑马鱼幼鱼及Tg(sox9b:GFP)和Tg(sp7:EGFP)转基因线路被暴露于递增浓度的5-HMF中。与以往主要关注一般发育和矿化表型的工作不同，本研究旨在通过检查软骨细胞形态、成骨相关发育和类破骨细胞活性，定义骨骼损伤的细胞组成成分。我们分析了软骨发育、骨矿化、类破骨细胞活性、ROS水平和骨骼基因表达，并使用ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）评估抗氧化干预是否能减轻这些骨骼改变。
章节摘要
斑马鱼培养与5-HMF暴露
成年AB、Tg(sox9b:GFP)和Tg(sp7:EGFP)斑马鱼线路在循环水系统中培养，光照/黑暗周期为14小时/10小时，恒温28 °C。每天饲喂三次。为获取胚胎，将雄性斑马鱼与雌性斑马鱼夜间配对，次日开灯后1小时内产卵。将胚胎置于含1×E3培养基和亚甲蓝（0.3 ppm）的10 cm培养皿中，在光控条件下（14小时/10小时
5-HMF抑制斑马鱼幼鱼软骨发育
天蓝色染色显示，与对照幼鱼相比，5-HMF处理组幼鱼软骨体积明显减少。筛板、Meckel软骨和舌骨区域的发育受到抑制，较高5-HMF浓度下表型更为严重（图1A）。
为进一步评估软骨细胞，将Tg(sox9b:GFP)胚胎暴露于5-HMF中并在4 dpf时检查。与对照幼鱼相比，筛板/颅面软骨中的软骨细胞
讨论
本研究探讨了斑马鱼幼鱼中5-HMF诱导的骨骼毒性相关的细胞过程。5-HMF暴露损害颅面软骨细胞，延迟软骨发育，减少成骨相关荧光和骨矿化，增加TRAP阳性的类破骨细胞活性，升高ROS水平并破坏骨骼基因表达。抗氧化剂NAC处理部分减轻了软骨异常、骨矿化缺陷和过度
结论
高浓度5-HMF在斑马鱼幼鱼中引起骨骼发育毒性，表现为软骨发育受损、骨矿化减少、类破骨细胞活性增加和骨骼基因表达紊乱。这些效应伴随ROS积累增加和抗氧化基因表达改变。NAC部分减轻了软骨、成骨相关和类破骨细胞表型，支持ROS积累对
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姜宇：文稿写作——审阅与编辑、原稿撰写、可视化、监督、项目管理、方法论、资金获取、数据整理、概念化。张晓丽：方法论、调查、数据整理。赵刚：资源、方法论、调查、数据整理。赖美玲：原稿撰写、方法论、调查、数据整理、概念化
伦理声明
本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经江南大学委员会批准。（批准号：QRl56-353）
伦理声明
所有斑马鱼实验均经江南大学动物护理和使用委员会批准，并遵循相关中国政府法规和动物福利指南进行。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
基金资助
本研究受江苏省卫生健康委员会科研项目资助[Z2022027]。
利益冲突声明
? 作者声明以下财务利益/个人关系可被视为潜在利益冲突：姜宇报告获得江南大学医疗中心的资金支持。姜宇与江南大学医疗中心存在关系，包括：受雇。姜宇有专利申请待批，编号无。如有其他作者，他们声明不存在可能影响本文报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
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