透明质酸寡糖的酶法制备及其毒理学评估

《Food Bioscience》：Enzymatic preparation and toxicological evaluation of hyaluronic acid oligosaccharide

　　

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  建立了一种高效且可控的酶法制备oHA（低分子量透明质酸）的工艺；最佳条件为：温度35°C，底物浓度40%（w/v），酶用量40 U/g，反应时间4小时。
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  所制备的oHA含有不饱和双键，平均分子量低于3 kDa。
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  小鼠急性口服毒性实验显示LD₅₀ > 16,000 mg/kg，MTD > 32,000 mg/kg，表明无急性毒性。
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  在28天的大鼠研究中，当剂量为1000 mg/kg时，仅出现轻微的ALP和PLT变化，所有指标均处于正常生理范围内。

引言

来自天然来源的生物活性多糖和寡糖因其在免疫调节、抗炎、抗氧化和抗肿瘤等方面的多功能生物活性，在功能性食品和生物医学领域受到了越来越多的关注（Kaewkumsan, Gavahian, Tseng, & Guo, 2025; Q. H. Liu et al., 2025）。这些生物大分子的功能表现与其分子量、聚合度、单糖组成及糖苷键连接模式密切相关（Junaid et al., 2025; M. M. Li, Wang, Li, Yu, & Du, 2025）。特别是低分子量的寡糖通常比高分子量多糖具有更好的组织渗透性和独特的信号传导活性，这使得它们成为很有前景的功能性食品成分（?imek et al., 2023）。

透明质酸（HA）是一种天然线性糖胺聚糖（GAG），由D-葡萄糖醛酸（GlcA）和N-乙酰-D-葡萄糖胺（GlcNAc）通过β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接而成（Gra?a, Miguel, Cabral, & Correia, 2020; Zhou et al., 2024）。HA及其降解产物低分子量透明质酸（oHA）具有多种生物功能，如抗炎、保湿、促进伤口愈合和调节免疫（Hauck et al., 2021; Kaul, Short, Keswani, & Wang, 2021）。值得注意的是，分子量低于3 kDa的oHA可以通过人体肠道壁吸收（?imek et al., 2023）。越来越多的证据表明，oHA能够调节关键的信号通路，包括Toll样受体（TLR）/核因子κB（NF-κB）通路，从而发挥其免疫调节和抗炎作用（Han et al., 2022; W. Liu et al., 2023）。

尽管具有这些有利性质，但oHA的实际应用仍受到一些挑战的限制。首先，高效且可控的、能制备出具有确定分子量的oHA的策略仍然较少，这限制了大规模生产（Pang et al., 2022）。其次，系统的口服安全性评估数据，尤其是亚慢性毒性数据，仍然不足。第三，制备过程、结构特征与oHA的生物安全性之间的关联尚未完全阐明（Han et al., 2022）。本研究基于市场对新型功能性食品成分oHA日益增长的需求而展开，这需要高效的生产技术和全面的安全性验证。目前主流的oHA降解方法（包括物理、化学和酶法）都存在固有的局限性。物理降解产生的产品分子量分布广泛且不均匀（D?ímalová, Velebny, Sasinková, Hromádková, & Ebringerová, 2005）；化学降解依赖于严苛的反应条件，可能会破坏活性功能基团（Gu, Cai, He, Fu, & Li, 2010; ?mejkalová et al., 2012）；酶法降解虽然被认为是最有前景的替代方案，但受到底物浓度低、反应时间长和酶成本高的限制（Cao et al., 2022; Pang et al., 2022; Valcarcel, García, Varela, & Vázquez, 2020）。此外，高浓度HA水溶液的高黏度以及酶解过程中控制分子量的难度仍然是关键技术挑战（J. Li et al., 2020）。此外，缺乏系统的毒理学数据，尤其是口服安全性数据，限制了oHA在功能性食品和口服产品中的应用（De Tollenaere et al., 2025）。

本研究旨在建立一种高效且可控的酶法制备低分子量oHA的工艺，表征其结构特征，并通过急性和亚急性毒性测试系统地评估其口服安全性。在本研究中，使用透明质酸裂解酶来降解HA，并优化了关键的酶水解参数。制备得到的oHA经过了生物安全性评估，并分析了其对实验动物的潜在毒性作用。与以往的研究相比，本研究着重提高了酶反应中的底物浓度，以获得可被肠道吸收的低分子量oHA。此外，还进行了口服毒性评估以提供oHA的安全性数据。这些发现为oHA作为功能性食品成分的工业应用提供了理论和实验基础，有助于推动生物活性多糖和寡糖领域的发展。

章节片段

oHA的制备

本研究中使用的透明质酸裂解酶由中国海洋大学的海洋微生物工程实验室生产和纯化，并对其进行了表征。该酶来源于海洋细菌Arthrobacter sp. CS01，并在Pichia pastoris X33中表达。1单位（U）酶活性定义为在37°C、20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 6.5）条件下，每分钟产生1 μmol不饱和二糖所需的酶量（Pang et al., 2022）。详细表征数据

水解时间和酶用量对oHA制备的影响

水解时间和酶用量是影响HA降解的关键因素。所有实验均在35°C下进行，该温度下透明质酸裂解酶表现出最佳稳定性。通过系统优化酶用量和反应时间，并采用分阶段增加底物浓度的批式投加方式。如图1和补充图S1–S2所示，HA的分子量随水解时间的变化而变化。收集了寡糖样本

讨论

HA是一种线性糖胺聚糖，其分子骨架由通过β-1,4糖苷键连接的二糖单体组成。作为高分子量HA的降解产物，oHA具有更好的组织渗透性和独特的信号调节活性，在功能性食品、生物医学和高端化妆品领域具有广阔的应用前景，近年来引起了广泛的研究兴趣。

结论

本研究建立了一种稳定且可扩展的酶法生产工艺，用于制备分子量低于3 kDa的结构完整的oHA，并提供了该产品的系统口服安全性数据。所开发的工艺适合工业化生产，获得的oHA满足食品级的纯度和安全性要求。这些发现为oHA在功能性食品及相关领域的应用奠定了坚实基础。然而，仍有若干方面尚未探索

CRediT作者贡献声明

Changliang Zhu: 撰写 – 审稿与编辑，项目管理，资金获取，概念构思。Haijin Mou: 撰写 – 审稿与编辑，资金获取。Yujing Jia: 撰写 – 初稿撰写，验证，方法学设计，实验研究。Yaxue Liu: 方法学设计，数据管理。Siyu Li: 方法学设计，数据管理，概念构思。Lin Zhu: 软件开发，数据分析。Yang Zhang: 数据分析。Junpeng Huang:资金获取，数据分析

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究工作的财务利益个人关系。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究工作的财务利益个人关系。

致谢

本研究得到了山东省重点研发计划项目（2024TZXD046）和青岛市科技创新计划关键技术突破项目（25-1-1-gjgg-53-hy）的财政支持

Yujing Jia|Siyu Li|Yaxue Liu|Yang Zhang|Lin Zhu|Junpeng Huang|Haijin Mou|Changliang Zhu