《Food Chemistry: X》：Targeted analysis of purine derivatives in beer and fermented beverages using HPLC-QDA
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高尿酸血症和痛风已成为迅速升级的全球公共卫生负担。2020年痛风患病率估计已达5580万例，较1990年总病例数增长150.6%（Cross et al., 2024）。在各类酒精饮料中，啤酒所含嘌呤浓度始终显著高于葡萄酒或蒸馏酒，这一差异归因于其谷物基原料和
高尿酸血症和痛风已成为迅速升级的全球公共卫生负担。2020年痛风患病率估计已达5580万例，较1990年总病例数增长150.6%（Cross et al., 2024）。在各类酒精饮料中，啤酒所含嘌呤浓度始终显著高于葡萄酒或蒸馏酒，这一差异归因于其谷物基原料和酵母来源的生物量。与健康意识提升同步，全球无醇啤酒（non-alcoholic beer, NAB）市场迅速扩张，然而物理脱醇工艺选择性去除乙醇的同时保留了众多溶解性非挥发性化合物，引发了对无醇啤酒能否可靠降低嘌呤暴露的质疑。尽管大麦麦芽被广泛认为是啤酒中嘌呤的主要来源，但替代性淀粉源在缓解嘌呤积累方面的潜力尚未得到全面评估。针对上述问题，本研究首先开发并应用了一种以选择离子记录（single ion recording, SIR）模式运行的靶向高效液相色谱-四极杆质谱检测器（HPLC-QDA）方法，作为高端串联质谱方法的实用、经济且可及性更高的替代方案，用于复杂饮料体系中嘌呤谱分析。该分析方法随后被用于系统定量美国市场上各类商业化酒精及无酒精饮料，以及采用明确辅料替代以调控原料组成的实验性无醇啤酒中的嘌呤碱基、核苷及嘧啶。通过将方法开发与受控饮料配方及广泛产品筛选相结合，本研究得以直接评估原料选择、加工策略及酒精控制对最终嘌呤负荷的影响，同时建立了一种适用于比较筛选和未来配方驱动研究的高效分析途径。
论文解读
一、研究背景与意义
高尿酸血症和痛风已成为全球范围内迅速升级的公共卫生负担。据估算，2020年全球痛风病例已达5580万例，较1990年增长150.6%，其中高收入地区的增幅尤为显著。流行病学证据表明，啤酒消费与痛风风险升高约1.5倍相关，而蒸馏酒消费仅与约1.15倍的风险升高相关，提示乙醇含量本身并不能完全解释啤酒的高尿酸血症效应，非酒精组分尤其是膳食嘌呤发挥着重要作用。
在各类酒精饮料中，啤酒因以谷物为原料并含有酵母来源生物量，其嘌呤浓度显著高于葡萄酒和蒸馏酒。与此同时，全球无醇啤酒市场快速扩张，但物理脱醇工艺（如膜过滤）仅选择性去除乙醇，而保留了大量溶解性非挥发性化合物，使得无醇啤酒是否真正提供更低的嘌呤暴露存在不确定性。此外，尽管大麦麦芽被广泛认为是啤酒中嘌呤的主要来源，替代性淀粉源（如大米、玉米、木薯、高粱等）在缓解嘌呤积累方面的潜力尚未得到系统评估。
在分析方法层面，传统高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）方法通常需要苛刻的水解和多步酶处理，样品前处理时间可长达数天；而更先进的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法虽具有更优的灵敏度和选择性，但依赖昂贵的三重四极杆系统，资源消耗大，限制了其在涵盖多种饮料基质的大规模比较筛选研究中的常规应用。单四极杆仪器技术复杂度较低、操作更简便，但传统选择离子记录（SIR）模式无法提供串联质谱中的前体-产物离子跃迁，限制其区分干扰物和确认分析物身份的能力。
二、研究目的
本研究旨在开发一种以SIR模式运行的靶向HPLC-QDA方法，作为高端串联质谱方法的实用、经济且可及性更高的替代方案，用于复杂饮料体系中嘌呤谱分析。该方法随后被应用于系统定量美国市场上各类商业化酒精及无酒精饮料，以及采用明确辅料替代以调控原料组成的实验性无醇啤酒中的嘌呤碱基、核苷及嘧啶，从而直接评估原料选择、加工策略和酒精控制对最终嘌呤负荷的影响。
三、关键技术与方法
研究人员开发并应用了基于Waters ACQUITY Arc高效液相色谱系统耦合Waters ACQUITY QDA单四极杆质谱检测器的靶向分析方法，采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1×100 mm，1.8 μm），流动相为含1.25 mM二己基乙酸铵（DHAA）的10 mM甲酸铵缓冲液（pH 5.0）和含1.25 mM DHAA的乙腈，流速0.3 mL/min，线性梯度洗脱40 min。检测在SIR模式下进行，采用正电喷雾电离监测除黄嘌呤（负离子模式）外的所有分析物。样品仅经离心和0.22 μm PTFE过滤处理，无需水解步骤，定量的是饮料中游离嘌呤碱基和核苷。
研究样本包括43种饮料：全强度啤酒（n=12）、商业化无醇啤酒（n=4）、自制实验性无醇啤酒（n=10）、清酒（n=6）、葡萄酒（n=2）、苹果酒（n=1）及各类蒸馏或调配饮料（n=8），均购自美国阿肯色州费耶特维尔当地零售渠道。实验性无醇啤酒在阿肯色大学食品科学系饮料创新中心使用两罐式循环中试酿造系统生产，采用麦芽糖阴性酿酒酵母菌株（Berkeley Yeast）发酵，最终乙醇浓度控制在0.40% v/v±0.1% v/v。
四、研究结果
4.1 不同饮料类别中嘌呤组成
研究发现，全强度啤酒的总嘌呤浓度最高且范围最宽，从45.6±2.8 mg/L（啤酒8）到223.4±11.1 mg/L（啤酒6）。深色麦芽基啤酒风格（如波特啤酒182.9±19.6 mg/L、桶陈黑麦艾尔199.9±13.2 mg/L）始终处于该范围上端，而浅色辅料丰富的拉格风格啤酒则持续较低。在所有啤酒中，鸟苷是主要嘌呤，约占总嘌呤的41%–68%。以啤酒6为例，一瓶12盎司约提供79.3 mg嘌呤，相当于日本推荐的痛风和高尿酸血症管理膳食嘌呤摄入量（400 mg/天）的19.8%。
商业化无醇啤酒的总嘌呤浓度因亚型不同而表现出显著变异性。采用膜过滤法生产的无醇啤酒与全强度啤酒在统计学上无显著差异（p>0.05），例如NAB 1（168.5±13.5 mg/L）与其全强度对应产品啤酒1（182.9±19.6 mg/L）相当。这表明“无醇”标识本身并不能可靠预测嘌呤含量的降低。
实验性无醇啤酒（采用麦芽糖阴性酵母生产）的总嘌呤浓度显著低于全强度啤酒（p<0.05），范围从0.7±0.3 mg/L到89.9±7.9 mg/L，平均值低于50 mg/L。100%麦芽大麦配方（NAB EXP 5，64.5±2.3 mg/L）和50%未发芽大麦配方（NAB EXP 8，68.8±2.4 mg/L）保留了较高嘌呤水平，而100%麦芽大米配方（NAB EXP 2，0.71±0.25 mg/L）极低。
相比之下，大米和水果基发酵饮料的嘌呤浓度较低。清酒总嘌呤范围为8.5±0.9 mg/L至40.2±3.7 mg/L，且以黄嘌呤为主要嘌呤（约37%–94%），次黄嘌呤占7%–24%，与啤酒中鸟苷主导的特征形成鲜明对比。红葡萄酒总嘌呤为29.7±1.0 mg/L，白葡萄酒未检出主要嘌呤碱基。蒸馏酒和调配饮料（威士忌、龙舌兰、烧酒、糖基硬苏打）均未检出嘌呤。
4.2 与啤酒总嘌呤浓度相关的因素
Pearson相关分析显示，总嘌呤含量与原麦汁浓度（°P；r=0.85，p<0.05）、酒精体积分数（r=0.78，p<0.05）、游离氨基氮（FAN；r=0.69，p<0.05）呈显著正相关。大麦麦芽比例与总嘌呤浓度呈显著正相关（r=0.63，p<0.05），而替代性淀粉比例呈显著负相关（r=?0.63，p<0.05）。总嘌呤与原麦汁浓度的相关性比与酒精含量的相关性更强，表明嘌呤积累与麦汁生产中麦芽衍生化合物的提取有关。酒精含量与嘌呤负荷的关系应理解为共变关系而非乙醇的直接效应。
4.3 生产方法与无醇啤酒中嘌呤保留
生产方法对无醇啤酒中嘌呤保留的变异性有贡献，但其效应次于原料组成。膜过滤法生产的商业化无醇啤酒未表现出相对于全强度对应产品的嘌呤浓度降低。采用蒸馏法生产的NAB 4（15.3±1.8 mg/L）较其全强度对应产品啤酒3（113.2±5.5 mg/L）降低约七倍，但由于嘌呤是非挥发性化合物，预计不会通过蒸发去除，研究人员推测这主要反映了基础配方的差异而非蒸馏过程本身。
实验性无醇啤酒的结果表明，原料投入主导嘌呤保留。采用50%替代性淀粉替代的实验性无醇啤酒总嘌呤浓度较100%麦芽对照降低约25%–51%，具体取决于辅料来源。研究人员提出，减少嘌呤保留的实际策略包括：在原料层面部分替代大麦麦芽为低蛋白、低核酸的替代性淀粉源；在发酵层面探索增强核苷利用的酵母菌株选择或工程化改造；以及在麦汁生产阶段采用酶法策略将嘌呤核苷转化为酵母更易同化的形式。
五、讨论与结论
研究讨论指出，大麦麦芽基啤酒代表了所评估饮料中最大的膳食嘌呤暴露来源，而清酒、葡萄酒、苹果酒和其他发酵饮料通常贡献较低嘌呤量。从嘌呤暴露角度，所检饮料可大致排序为：啤酒＞清酒/葡萄酒/其他发酵饮料＞蒸馏饮料。然而，这一排序反映的是相对膳食嘌呤暴露而非整体痛风风险，因为乙醇本身可能独立影响尿酸代谢。
研究结论指出，发酵饮料中嘌呤水平主要由原料选择决定，而非发酵动力学或最终乙醇浓度。大麦麦芽是嘌呤负荷的主要贡献者，以高鸟苷水平为特征；大米基清酒则呈现独特的黄嘌呤主导特征。“无醇”标识并非降低嘌呤含量的可靠预测指标。以低核酸替代性淀粉替代50%大麦麦芽可使总嘌呤浓度降低约25%–51%。嘌呤水平与原麦汁浓度、FAN和麦芽比例之间的强相关性强化了糖化过程中核蛋白增溶与嘌呤释放之间的机制联系。研究局限性包括：商业化样本仅代表所选产品而非整个饮料类别；每个实验配方仅生产单一批次；方法仅定量游离嘌呤碱基和核苷，未包含核苷酸或完整核酸中的嘌呤；未在所有饮料类型中进行基质特异性验证。这些发现为通过合理的谷物配方优化、靶向核苷酶解或选择具有增强嘌呤同化能力的酵母菌株来开发“低嘌呤”饮料提供了框架。
