《Food Chemistry: X》：Associations between volatile flavour compounds and microbial communities during the fermentation of traditional mould-fermented Sufu
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采用顶空-气相色谱-质谱联用（HS-GC–MS）共鉴定出105种挥发性化合物，其中13种潜在关键香气活性化合物通过相对气味活度值（ROAV）分析筛选获得。传统霉菌发酵腐乳发酵过程中观察到明显的微生物演替，真菌群落以Ascomycota、Thermomyces和
采用顶空-气相色谱-质谱联用（HS-GC–MS）共鉴定出105种挥发性化合物，其中13种潜在关键香气活性化合物通过相对气味活度值（ROAV）分析筛选获得。传统霉菌发酵腐乳发酵过程中观察到明显的微生物演替，真菌群落以Ascomycota、Thermomyces和Thermoascus为主，细菌群落以Proteobacteria和Acinetobacter为主。Pearson相关分析（Pearson correlation analysis）揭示优势微生物类群与潜在关键香气活性化合物之间可能存在关联。
传统霉菌发酵腐乳（Sufu）是中国具有代表性的传统发酵豆制品。其通常接种霉菌发酵剂，如Mucor属，经前发酵和后盐腌制熟成，形成独特风味和质构。与工业发酵产品相比，传统产品保留更复杂的微生物生态系统和更丰富的风味。腐乳风味形成是复杂生化过程，微生物持续降解和转化大豆蛋白、脂质和碳水化合物，产生醇、醛、酯等风味活性化合物。以往研究已在灰腐乳、红腐乳和臭豆腐等产品中揭示微生物群落与风味特征，并在酱油、醋和发酵酒精饮料中发现微生物群落组成变化与关键风味化合物形成相关。然而，传统霉菌发酵腐乳中挥发性风味化合物动态变化的微生物生态基础仍认识不足，微生物演替与风味形成的关系需进一步研究。顶空-气相色谱-质谱联用（HS-GC–MS，headspace gas chromatography–mass spectrometry）和高通量测序（high-throughput sequencing）已成为表征发酵食品风味化合物和微生物演替的重要工具，相对气味活度值（ROAV，relative odour activity value）可整合气味阈值和相对丰度评估香气贡献。因此，研究人员以传统生产的霉菌发酵腐乳为对象，采集1、3、6、9、12和15 d发酵阶段样品，分析挥发性风味化合物变化，利用ROAV筛选潜在关键香气活性化合物，并通过高通量测序表征细菌和真菌群落演替，进一步进行关联分析，以理解传统腐乳风味形成中潜在微生物关联，并为风味调控、工艺优化和质量提升提供理论基础。
在关键技术方法方面，研究人员以传统霉菌发酵腐乳为样本来源，在发酵1、3、6、9、12和15 d取样，并以三个独立批次形成三个生物学重复。霉菌发酵剂购自 Hubei Chuzhai Fermentation Products Co., Ltd.，豆腐、辣椒粉、花椒粉和清香型白酒（Erguotou，42% v/v）等为本地采购。主要技术包括：HS-GC–MS分析挥发性风味化合物；ROAV筛选潜在关键香气活性化合物；高通量测序分析细菌16S rRNA基因V3+V4区和真菌ITS1区群落；利用QIIME2等流程进行序列处理与分类注释；采用Pearson相关分析评估微生物群落与潜在关键香气活性化合物的关联。
3.1 不同发酵阶段腐乳中挥发性风味化合物变化分析。通过HS-GC–MS分析，共鉴定出105种挥发性风味化合物，包括25种醇、8种醛、7种酮、7种酸、16种酯、29种萜烯和芳香化合物、1种酚、1种醚、1种呋喃和10种其他化合物。发酵过程中，醇类总体呈先增加后下降趋势；醛类和酮类相对含量较稳定；酸类持续增加并逐渐成为主要组分之一；酯类中后期逐渐增加；萜烯和芳香化合物早期较高后下降；酚、醚、呋喃等含量较低。该结果表明不同发酵阶段挥发性风味化合物发生动态变化，并呈现类别特异性演替。
3.2 腐乳发酵过程中潜在关键香气活性化合物的鉴定。通过ROAV分析，共鉴定出13种潜在关键香气活性化合物（ROAV>1）和6种香气修饰化合物（0.1≤ROAV≤1），主要属于醇、醛、酯、萜烯和芳香化合物及呋喃。早期Linalool的ROAV最高，后期1-Butanol, 3-methyl-成为ROAV最高化合物，提示香气轮廓由较清新花香向发酵醇厚转变。醇类是潜在关键香气活性化合物中最大类别，包含5种；1-Butanol, 3-methyl-、Linalool和1-Octen-3-ol在多个阶段维持较高ROAV。Benzeneacetaldehyde和Hexanal在多个阶段保持较高ROAV。Butanoic acid, ethyl ester和Hexanoic acid, ethyl ester主要在中后期出现且ROAV逐渐增加。d-Limonene、dihydroactinidiolide和Furan, 2-pentyl-也具有较高ROAV。该结果说明腐乳特征风味由多类潜在关键香气活性化合物协同构成，而非单一香气组分决定，并为其与微生物群落的关联分析提供基础。
3.3 腐乳发酵过程中微生物群落结构分析。3.3.1 Alpha多样性分析。通过Alpha多样性（Alpha diversity）指数分析，真菌在早中期丰富度总体高于细菌，第15 d细菌丰富度较高；Simpson指数显示真菌在所有采样日持续高于细菌；Shannon指数在第1 d细菌略高，第3 d后真菌高于细菌。Coverage值接近1，稀释曲线随测序深度增加趋于平台，表明测序数据可较准确反映腐乳样品真实微生物组成，且真菌和细菌群落在丰富度和多样性上具有不同时间轨迹。
3.3.2 分类注释统计。通过分类注释统计，真菌群落共注释到6界、42门、112纲、215目、329科、410属和449种；细菌群落共注释到6界、49门、70纲、169目、248科、335属和442种。该结果表明测序数据在多个分类水平具有足够分辨率，支持后续群落结构分析。
3.3.3 真菌群落结构分析。门水平上，Ascomycota、Mucoromycota和Basidiomycota为主要真菌门，其中Ascomycota在整个发酵过程中占绝对优势，范围约为74.62%至81.96%；Mucoromycota为第二优势门；Basidiomycota丰度较低。属水平上，Thermomyces和Thermoascus为优势属，分别约为26.59%至28.32%和22.43%至26.70%；Pichia保持相对稳定，Rhizopus和Rhizomucor持续存在。该结果提示这些真菌类群可能参与蛋白和脂质降解、酯类形成以及腐乳质构和风味形成。
3.3.4 细菌群落结构分析。门水平上，Proteobacteria和Firmicutes为主要细菌门，其中Proteobacteria占优势，范围约为89.69%至81.13%；Firmicutes在发酵后期逐渐增加。属水平上，Acinetobacter、Enterobacter和Pseudomonas为优势属；Pseudomonas在整个发酵过程中较稳定；Enterobacter后期逐渐成为优势属，达到40.27%；Acinetobacter早期占比较高，由63.08%降至24.93%；Saccharibacillus逐渐出现。研究人员同时指出，Acinetobacter、Enterobacter和Pseudomonas为异质性属，部分成员可能与食品腐败或潜在安全风险相关，其具体功能和安全意义仍需进一步验证，不能假定其仅促进风味形成。
3.4 潜在关键香气活性化合物与微生物群落结构的关联分析。通过Pearson相关分析，在门和属水平上评估潜在关键香气活性化合物与微生物群落的关联。热图显示，Ascomycota、Pichia、Thermoascus、Thermomyces、Proteobacteria和Acinetobacter形成一簇，并与多数关键醇、醛和酯呈正相关；Mucoromycota、Basidiomycota、Firmicutes、Bacteroidota、Enterobacter、Saccharibacillus和Pseudomonas形成另一簇，并与多数潜在关键香气活性化合物呈负相关。具体而言，Ascomycota与1-Butanol, 3-methyl-、Heptanal和Furan, 2-pentyl-显著正相关（p<0.05）；Pichia与Linalool、Eucalyptol、Butanoic acid, ethyl ester和d-Limonene显著正相关（p<0.05）；Mucoromycota与1-Butanol, 3-methyl-极显著负相关（p<0.01），并与Heptanal和Furan, 2-pentyl-显著负相关（p<0.05）；Acinetobacter与Heptanal显著正相关（p<0.05）；Enterobacter和Saccharibacillus均与dihydroactinidiolide显著正相关（p<0.05）；Bacteroidota与Hexanoic acid, ethyl ester显著负相关（p<0.05）。该结果表明不同微生物类群可能与风味形成存在不同关联，正负相关微生物组形成相对独立的关联簇，为功能菌筛选和风味形成机制验证提供初步依据。
讨论部分总结：研究人员指出，本研究虽揭示传统腐乳发酵过程中挥发性风味化合物和微生物群落变化及其潜在关联，但存在若干局限。首先，挥发性风味化合物采用GC–MS面积归一化法半定量，ROAV为相对估计而非绝对香气影响评价；微生物相对丰度和挥发性化合物相对含量均具有组成数据特征，Pearson关联可能受闭合效应影响，未来可采用中心对数比（CLR）转换、SparCC或比例分析等方法。其次，关联分析基于6个发酵阶段的Pearson相关分析（n=6），样本量有限，统计功效受限，且未进行多重检验校正，因此观察到的关联应视为探索性关联，而非直接因果证据；未来需扩大样本量、增加生物学重复并采用错误发现率（FDR）校正。此外，pH、水分、盐浓度和发酵温度等理化因素未纳入当前关联分析，未来整合理化特征、微生物动态和风味轮廓将更全面理解风味形成机制。尽管如此，该研究为识别潜在风味相关微生物及后续验证研究提供基础，并为腐乳风味调控和发酵剂开发提供信息。
研究结论翻译：将HS-GC–MS和高通量测序相结合，表征了传统腐乳整个发酵周期中的挥发性风味化合物和微生物群落。共检测到105种挥发性化合物，其中13种经ROAV分析鉴定为潜在关键香气活性化合物，涵盖醇类（2-pentanol、isoamyl alcohol、linalool、eucalyptol、1-octen-3-ol）、醛类（heptanal、benzeneacetaldehyde、hexanal）、酯类（ethyl butanoate、ethyl hexanoate）、萜烯类（d-limonene、dihydroactinidiolide）和呋喃类（2-pentylfuran）；两种酯仅在中后期产生。真菌群落丰富度和多样性总体高于细菌群落，但该模式随发酵阶段和多样性指标而变化。真菌门水平以Ascomycota为优势，其次为Mucoromycota和Basidiomycota；真菌属水平以Thermomyces和Thermoascus为优势。细菌群落以Proteobacteria和Firmicutes为主；属水平以Acinetobacter、Enterobacter和Pseudomonas为优势。Pearson关联分析揭示这些群落与潜在关键香气活性化合物之间可能存在关联：Ascomycota、Thermomyces、Thermoascus、Pichia和Proteobacteria与醇、醛和酯呈正相关，而Mucoromycota、Basidiomycota、Firmicutes和Bacteroidota主要呈负相关。综上，这些结果表明，Ascomycota相关真菌（Thermomyces、Thermoascus、Pichia）与Proteobacteria的协同活动，而非任一组单独作用，可能与腐乳发酵过程中关键醇、醛和酯的积累相关；而Mucoromycota和Firmicutes在该过程中的作用可能相对有限甚至具有抑制作用。这些发现提示真菌和细菌在风味形成中可能具有协同和拮抗作用，并为传统腐乳微生物群落靶向调控和风味品质改良提供理论基础。
