《Food Microbiology》：Multi-omics and functional validation profiling reveals the regulatory mechanism of biofilm-forming
Tetragenococcus halophilus JY1 in response to salt tolerance
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摘要生物膜对于提高微生物在工业应用中的生产力至关重要，但功能性微生物中生物膜抗逆性和形成机制的研究仍不够充分。Tetragenococcus halophilus（嗜盐乳杆菌）是一种嗜盐乳酸菌，在传统发酵工业中被广泛应用；然而，相关研究主要集中在其浮游状态。为弥补这一不足，本
摘要
生物膜对于提高微生物在工业应用中的生产力至关重要，但功能性微生物中生物膜抗逆性和形成机制的研究仍不够充分。Tetragenococcus halophilus（嗜盐乳杆菌）是一种嗜盐乳酸菌，在传统发酵工业中被广泛应用；然而，相关研究主要集中在其浮游状态。为弥补这一不足，本研究探讨了T. halophilus JY1在低盐（0.2 M，LS）和高盐（3 M，HS）胁迫条件下的生物膜形成分子机制。生理分析表明，生物膜在LS和HS条件下保护了细胞完整性，表现为ATP酶活性和ATP浓度的显著升高。此外，盐胁迫改变了JY1生物膜的丰度和组成。RNA-seq分析鉴定出与细胞表面组成、能量稳态和离子转运相关的基因表达上调。代谢组学分析进一步揭示，在LS和HS条件下，JY1中甘油磷脂和脂肪酸水平升高。功能验证进一步表明，ohrR、yodB、isaA、icaA、ruvA和ctsR的过表达显著促进了重组菌株的生物膜形成。此外，外源单不饱和脂肪酸（C16:1、C14:1和C20:1）通过调节膜脂质组成和增强渗透适应性，显著提高了细胞在盐胁迫下的存活率和生物膜形成。总体而言，生物膜的重构是JY1响应盐胁迫的关键适应策略，而长期盐暴露则降低了生理和代谢活性。本研究为理解生物膜微生物的适应策略提供了重要见解，并为生物膜在工业过程中的应用开辟了新途径。
引言
生物膜是细菌的主要存在方式，对微生物的生存、定殖和营养获取至关重要。这些结构由嵌入自产的多糖、蛋白质和核酸基质中的微生物细胞组成，附着在生物或非生物表面（Le Montagner等，2024）。生物膜形成过程包括附着、不可逆附着、增殖、成熟和分散等不同阶段。其中，成熟生物膜赋予微生物卓越的适应特性，使其能够抵御环境胁迫（Yao等，2024）。虽然生物膜的形成使食源性病原体的控制和根除变得更加复杂，但也促使研究关注病原微生物中生物膜形成的机制和调控（Sharma等，2023）。相反，功能性微生物的成熟生物膜在生物修复、有毒废水处理和抗菌化合物生产等方面发挥着积极作用（Zaiden等，2025）。然而，乳酸菌（LAB）的生物膜形成和功能特性研究相对不足，在工业应用中具有巨大潜力。
尽管乳酸菌生物膜的结构和组成特征已有较好的表征，但控制LAB生物膜形成和调控的机制仍不清楚。Tetragenococcus halophilus是一种广泛存在于高盐发酵食品中的嗜盐乳酸菌，常作为酱油、虾酱和鱼露的发酵菌种以增强风味。在食品加工过程中，T. halophilus会面临渗透压、温度波动、酸性和氧气暴露等多种胁迫，这些都会影响其活性。先前的研究已探讨了非生物膜形成型T. halophilus的胁迫响应机制。Lin等（2017）强调了甘氨酸甜菜碱转运系统和精氨酸代谢途径对非生物膜形成型T. halophilus盐胁迫适应的重要性。相比之下，Yao等（2022）发现，形成生物膜的T. halophilus在非生物表面形成生物膜后表现出增强的乙醇耐受性。此外，微生物生物膜形成和环境响应的机制高度依赖于环境条件和菌株特异性差异，这给研究生物膜对胁迫的响应和调控机制带来了挑战。因此，通过多组学方法和基因编辑技术研究T. halophilus在盐胁迫下的生物膜形成至关重要。
系统生物学和高通量技术的最新进展促进了组学技术在揭示微生物生物膜形成和胁迫响应机制方面的应用。多组学方法整合了基因转录、蛋白质表达和细胞代谢等方面的见解，与单组学分析相比提供了更全面的理解（Yuan等，2023）。转录组学和代谢组学已被广泛应用于阐明细菌生物膜形成和抗逆机制。例如，一项关于铜绿假单胞菌PAO1的研究揭示，群体感应和抗氧化酶活性的破坏会降低生物膜形成，导致菌株活性、毒力和致病性的降低（Chen等，2023）。此外，Liu等（2021）通过转录组学和代谢组学分析证明了群体感应、双组分系统和氨基酸代谢对长双歧杆菌生物膜形成的重要性。目前，大多数关于LAB的研究集中在生物膜状态和浮游状态之间的差异基因表达，凸显了通过基因工程增强LAB生物膜形成以提高其在极端条件下稳定性的需求。例如，Kong等（2022）通过基因工程改造嗜酸乳杆菌NCFM过表达galT，使胞外多糖（EPS）产量增加17.8%，并显著提高了冻干存活率。此外，补充外源物质有助于验证细胞对环境胁迫响应的功能通路。Wang等（2021a）证明补充脂肪酸，如月桂酸（C12:0）、棕榈油酸（C16:1）和油酸（C18:1），可加速细胞增殖并增加生物量。同时，脂肪酸合酶（FAS）抑制剂千里光菌素已被用于研究脂肪酸合成的调控（Bernard等，2024）。尽管取得了这些进展，T. halophilus在盐胁迫下生物膜形成与环境胁迫之间的关系仍不清楚。
因此，本研究聚焦于形成生物膜的T. halophilus JY1，利用多组学、基因编辑和外源物质补充技术探索盐适应条件下生物膜形成和调控的机制。首先，通过检测JY1的胞内和胞外微环境分析其在盐胁迫下的生理特征。其次，利用RNA测序和代谢组学对盐胁迫下JY1生物膜细胞的基因转录和代谢特征进行画像，鉴定关键基因和通路。最后，利用遗传重组和外源物质补充验证这些关键基因和通路的功能。本研究为LAB生物膜的工业应用提供了科学基础，为其适应机制和生物技术创新的潜力提供了有价值的见解。
章节摘要
T. halophilus JY1、培养条件及盐处理细菌细胞的制备
形成生物膜的菌株JY1是从工业规模的高盐液态醪液（中国广东）中分离获得，并保存于广东微生物菌种保藏中心（GDMCC，编号64178）。将储存在?80 °C的JY1甘油菌种接种到含1 M NaCl的de Man, Rogosa and Sharpe（MRS）肉汤中（接种体积2%），在32 °C下静置培养至对数中期（21小时）。将细菌细胞转入100 mL含0.2 M NaCl的MRS肉汤中（低...
细胞形态分析
细胞壁和膜是介导微生物与外部环境相互作用的重要屏障，直接影响细胞的生理和生化功能。此外，细胞形态和超微结构通常用于评估微生物在环境胁迫下的生长或耐受性。在本研究中，采用扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）从不同角度研究盐胁迫是否改变了细菌细胞形态和结构（图1）。SEM图像...
结论
综上所述，本研究通过生理特性、转录组学、代谢组学、过表达和外源脂肪酸补充分析，探讨了低盐（LS）和高盐（HS）条件下形成生物膜的JY1的细胞响应和自适机制。我们的结果表明，在盐胁迫下，生物膜形成保护了细胞完整性，显著提高了ATP酶活性和ATP水平。盐胁迫还引起生物膜丰度和组成的显著变化...
CRediT作者贡献声明
Chi Zhao：撰写–审阅与编辑，撰写–初稿，验证，软件，方法学，数据整理，概念构思。Dongdong Sun：撰写–审阅与编辑，方法学，概念构思。Shenmiao Li：撰写–审阅与编辑，形式分析。Xiaonan Lu：撰写–审阅与编辑，指导，形式分析。Xudong Liu：撰写–审阅与编辑，方法学。Yu Mu：概念构思。Lixin Luo：撰写–审阅与编辑，资源，项目管理，资金获取
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
致谢
本工作得到广东省自然科学基金（2024A1515012719）、贵州省科技计划项目（黔科合基础MS[2026]756）、仁怀市科技计划项目（[2026]08）、茅台研究院科技创新团队（MTXYTD202502）和茅台研究院科学学者研究基金（mygccrc[2023]008）的支持。
Chi Zhao|Dongdong Sun|Shenmiao Li|Xiaonan Lu|Xudong Liu|Yu Mu|Lixin Luo
中国贵州仁怀茅台学院食品工程学院，邮编564507
