酸性诱导花生凝集蛋白构象重排对黄曲霉毒素B1结合的双向调控：多光谱与分子模拟研究

《Food Research International》：Acid-induced conformational remodeling of arachin bidirectionally modulates aflatoxin B1 binding: a multi-spectroscopic and molecular simulation study

　　

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  弱酸条件（pH 5.0 → 8.0）诱导落花生球蛋白展开，增强AFB1结合。
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  pH 3.0 → 8.0诱导不可逆解离和α螺旋丧失，损害AFB1结合。
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  酸诱导的聚集捕获AFB1，增加检测和解毒难度。
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  pH依赖的构象重塑调节AFB1-疏水相互作用。
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  为规避加工过程中AFB1残留风险增加提供指导。

引言

花生在保障食用油供应和促进农业经济发展方面发挥着关键作用。然而，花生在种植、储存和加工过程中极易受到黄曲霉污染。由此产生的黄曲霉毒素B1（AFB1）具有强效的肝毒性和致癌性，对食品安全和人类健康构成严重威胁。尽管AFB1的检测方法日趋成熟，但当应用于花生等基质高度复杂的产品时，其准确性和有效性可能会受到影响（Li, Jiang, et al., 2026）。主要原因可能是污染物通过共价或非共价相互作用与生物大分子（如淀粉、纤维素、蛋白质）紧密结合，形成所谓的基质结合型污染物（Berthiller et al., 2009; Tan, Zhou, Guo, Zhou, Wang, et al., 2024; Zhang et al., 2020）。这种结合不仅干扰AFB1的准确检测，还要求在有效解毒之前将毒素从基质中解离。花生蛋白已被确认为限制AFB1解毒的主要瓶颈（Li, Jiang, et al., 2026; Li, Wang, & Ji, 2026）。

花生蛋白因其氨基酸组成均衡、消化率高和良好的功能特性，现已广泛应用于食品Processing、饲料生产和营养强化（Guo et al., 2025）。落花生球蛋白（Ara）是一种350 kDa的六聚体储存蛋白，理论等电点约为5.0–5.2，通过非共价相互作用和二硫键稳定，占花生总蛋白的60%以上（Liu et al., 2020）。这种六聚体结构不仅赋予其理化稳定性，还组织了能够容纳小疏水分子的疏水腔和结合位点（Lu Chen et al., 2025; Tan et al., 2025）。Ara的六聚体组装主要由亚基间的疏水相互作用和离子键（盐桥）维持，两者均对pH和离子强度高度敏感。特别是，酸性条件可通过改变电荷分布来诱导Ara的解离或聚集，进而可能调节这些结合区域的暴露程度和可及性，从而深刻影响Ara对AFB1的保留能力（Lin Chen, Zhang, & Zhang, 2024）。

阐明控制基质-污染物相互作用的结构-活性关系，为开发高效解毒策略提供了重要的理论基础（Furlong et al., 2024）。目前，关于评估生物大分子与污染物之间结构-活性关系的研究可大致分为三种方法：（i）固定蛋白质结构，改变小分子结构以阐明结合选择性（Xing et al., 2024）。（ii）固定小分子结构，改变蛋白质类型以精确定位关键结合决定因素（B. Zhang et al., 2023）。（iii）通过环境因素（如pH、温度）直接调节蛋白质结构，以研究构象依赖性活性变化（Bagheri & Fatemi, 2018; Tan et al., 2021; Zhang et al., 2023）。在这些策略中，酸处理为研究Ara提供了一种独特优势，因为它能够分级且可逆地调节其六聚体组装，从而允许精确解析控制AFB1结合的构象决定因素。相比之下，热处理往往诱导全局性且通常不可逆的变性，使结构-活性关系的解读变得复杂。因此，本研究选择酸处理作为靶向工具，系统研究pH驱动的Ara构象重塑如何调节其AFB1结合亲和力。

鉴于酸处理技术在食品加工业中的广泛应用，以及其能够诱导Ara产生显著的结构和功能变化，系统研究酸对Ara结构及其AFB1结合能力的影响具有重要的实际意义（Zhao et al., 2016）。有趣的是，目前报道表明酸处理对蛋白质-分子相互作用的影响并非单向的。一方面，酸处理可增强蛋白质与小分子之间的结合能力。Tan报道称，酸处理通过诱导结构重排、形成更多疏水腔并增强疏水相互作用，从而增强了醇溶蛋白-玉米赤霉烯酮的结合（Hongxia Tan, Zhou, Guo, Zhou, Zhang, et al., 2024）。这种更强的相互作用可能给检测和解毒都带来挑战，因为毒素更难从蛋白质基质中解离。酸处理还被战略性地用于增强蛋白质-小分子结合亲和力以实现保护目的。例如，Chen证明超声处理或酸预处理显著增强了乳清蛋白与表没食子儿茶素没食子酸酯之间的相互作用，从而提高了后者的稳定性和抗氧化能力（Chen et al., 2019）。另一方面，也有报道称酸处理会削弱蛋白质与小分子之间的结合能力。具体而言，Xiao证明酸性条件减弱了草鱼肌原纤维蛋白与异味醛类之间的疏水相互作用，导致结合常数降低和结合位点数量减少（Xiao et al., 2025）。这种结构调节促进了醛类从蛋白质基质中的释放，从而促进了脱臭。酸处理的这种差异化效应可能与蛋白质类型、小分子性质和处理条件密切相关。现有研究仍需系统阐明酸性条件下污染物结合行为的调控机制。假设酸处理和pH变化会诱导Ara的构象重塑，包括解离、重新组装以及疏水区域和结合位点暴露程度的改变，从而动态调节Ara与AFB1之间的结合亲和力、结合力和稳定性。

为阐明酸处理如何调节Ara-AFB1结合，本研究采用了多种光谱技术和分子模拟方法。我们系统研究了酸处理（pH 3.0和5.0）期间以及重新调节至pH 8.0后的Ara构象重塑。具体而言，我们分析了构象稳定性、聚集状态、游离巯基含量和表面疏水性，以定量评估这些特征如何影响AFB1结合能力，并识别促进或削弱结合的结构决定因素。本研究提供了pH诱导的Ara构象变化及其对AFB1结合影响的机制性理解，为酸性食品加工过程中管理AFB1风险提供了理论基础。

章节摘要

试剂与化学品

花生蛋白分离物（PPI，≥90%）和透析袋（10 kDa）购自源叶（中国上海）。C18反相柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）购自安捷伦科技（美国加利福尼亚州）。AFB1免疫亲和柱购自Casco（德国法兰克福）。AFB1（≥99%，CAS：1162-65–8）、乙腈（CAS：75–05–8）、甲醇（CAS：67–56-1）、(NH?)?SO?（CAS：7783-20-2）、NaCl（CAS：7647-14-5）和考马斯亮蓝G250（CAS：6104-58-1）购自

溶解度、浊度和ζ电位

蛋白质溶解度、浊度和表面电荷是蛋白质行为和胶体稳定性的关键宏观指标。如图1A和B所示，酸处理显著降低了Ara在pH 3.0和pH 5.0条件下的溶解度，并增加了浊度，其中pH 3.0时效果更为明显（p < 0.05）。值得注意的是，pH 5.0 → 8.0组在中性化后溶解度完全恢复，而pH 3.0 → 8.0组则表现出未完全恢复和持续升高的

结论

本研究系统探讨了酸处理和中性化对Ara构象及其对AFB1结合行为的影响。结果表明，结构变化与AFB1结合亲和力之间的关系并非单调的；相反，结合能力的双向调节根本源于构象重排，并受结构-活性关系控制。Ara通过以疏水

作者贡献声明

Mohan Li：论文撰写–初稿撰写、方法论、调查、数据整理。Jiahao Yuan：可视化。Dian Zhou：软件。Kewei Chen：项目管理。Muying Du：项目管理。Zsolt Zalán：项目管理。Sameh Awad：项目管理。Jianquan Kan：论文撰写–审阅与编辑、监督、资源提供、项目管理、概念构思。

资金支持

本研究得到国家重点研发计划（编号2024YFE0213900）和国家重点研发计划（编号2021YFE0116500）的支持。

利益冲突声明

作者声明，不存在任何已知可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

Mohan Li|Jiahao Yuan|Dian Zhou|Kewei Chen|Muying Du|Zsolt Zalán|Sameh Awad|Jianquan Kan