《International Dairy Journal》：Molecular and phenotypic adaptations of
Lacticaseibacillus paracasei Zhang to acid and cold stress during transition into the viable but non-culturable state
编辑推荐：
•低温和酸应激可诱导Lacticaseibacillus paracasei Zhang进入VBNC状态。•尽管失去可培养性，细胞仍保持活性。•蛋白质组学揭示代谢向能量节约方向的转变。•磷酸转移酶系统（PTS）可能是应激适应中一条潜在的重要途径。•结构建模支持PTS酶I-磷酸
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低温和酸应激可诱导Lacticaseibacillus paracasei Zhang进入VBNC状态。
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尽管失去可培养性，细胞仍保持活性。
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蛋白质组学揭示代谢向能量节约方向的转变。
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磷酸转移酶系统（PTS）可能是应激适应中一条潜在的重要途径。
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结构建模支持PTS酶I-磷酸烯醇式丙酮酸相互作用的增强。
引言
乳酸菌（LAB）是革兰氏阳性、非产孢、过氧化氢酶阴性的微生物，广泛分布于发酵食品、胃肠道及自然环境中（Abedi & Hashemi, 2020; Ayivi et al., 2020）。在加工、冷藏储存及胃肠道转运过程中，这些具有重要工业价值的菌株经常面临低温、酸性及渗透压等胁迫，从而影响其活性和功能性表现（Duwat et al., 2000; Foddai & Grant, 2020）。在此类条件下，许多菌株会进入活的但不可培养（VBNC）状态，其特征是在标准培养基上失去形成菌落的能力，但仍保持代谢活性和复苏潜力（Hood & Ness, 1982）。VBNC状态最早在水生霍乱弧菌（Vibrio cholerae）和大肠杆菌（Escherichia coli，简称E. coli）中被描述（Xu et al., 1982），目前已被确认为超过100种细菌共有的休眠策略（Cai et al., 2022; Dong et al., 2020; Gao et al., 2021）。尽管VBNC现象最初主要被记录于革兰氏阴性病原体中，但越来越多的报道称革兰氏阳性非致病菌也会出现VBNC状态，包括益生菌乳酸菌（Liu et al., 2017; Pinto et al., 2015）。尽管其认知度不断提高，益生菌乳酸菌菌株中VBNC诱导和维持的分子机制仍未得到充分阐明。揭示这些通路对于开发保持可培养性的策略、防止加工过程中非预期的活性损失以及优化工业益生菌制剂的稳定性至关重要（Nowakowska & Oliver, 2013; Wang et al., 2026）。
Lacticaseibacillus paracasei Zhang，最初于2001年从内蒙古锡林郭勒盟传统发酵酸马奶中分离，是中国首个完成全基因组测序的乳酸菌（Guo et al., 2009; Ma et al., 2023; Wu et al., 2009; Zhang et al., 2008）。该菌株已被广泛应用于酸奶、功能饮料、益生菌粉及饲料添加剂中（Peng et al., 2022; Ujiroghene et al., 2019; Zhang et al., 2010）。近期研究表明，该菌株在低温和酸性复合条件下可转变为VBNC状态（Bao et al., 2023），由此提出假设：特定分子重编程，尤其是在蛋白质组水平上的重编程，是其适应性存活的基础。阐明这些机制可为保存或复苏VBNC益生菌的策略提供依据，从而优化其在食品和健康领域的应用效果（Pazos-Rojas et al., 2024）。
定量蛋白质组学能够系统性地分析应激诱导的蛋白质变化，已被广泛用于解读病原体中VBNC的调控特征（Hussain et al., 2013; Xu et al., 2021），包括E. coli O157:H7和 Cronobacter sakazakii（Jameelah et al., 2018; Se et al., 2021）。这些研究揭示了VBNC的关键机制，包括营养匮乏条件下ATP耗竭驱动的蛋白质聚集（Pu et al., 2019）。由于传统的培养依赖性活性检测方法（如在选择性培养基上进行平板计数）无法检测或量化不可培养细胞，蛋白质组学分析已成为鉴定食品级益生菌乳杆菌VBNC表型分子标志物和核心调控网络不可或缺的工具（Foglia et al., 2020）。
迄今为止，L. paracasei Zhang的VBNC状态蛋白质组学图谱尚未被表征。我们假设，暴露于低温、低pH和营养限制等复合胁迫条件下，将触发协调性的蛋白质组重编程，以支持代谢下调、应激防御和细胞完整性维持，从而促进VBNC状态的进入与持续。在本研究中，我们评估了多种应激条件，以确定能够重复性诱导VBNC状态并能获得足够生物量供下游分析的条件。利用可培养性检测、荧光活性染色和扫描电子显微镜（SEM）监测表型转变。随后，采用串联质量标签（TMT）定量蛋白质组学技术比较对照细胞与VBNC细胞的全局蛋白质表达，以鉴定差异表达蛋白（DEPs）、富集通路及关键调控枢纽。通过整合功能注释、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析（STRING数据库；Szklarczyk et al., 2019）及分子对接，提出该益生菌菌株VBNC适应的机制模型。
章节摘录
菌株
Lacticaseibacillus paracasei Zhang由内蒙古农业大学教育部乳品生物技术与工程重点实验室提供，并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 1697。将储存于?80 °C的L. paracasei Zhang甘油冻存菌种解冻后，接种至5 mL的de Man, Rogosa, and Sharpe（MRS）肉汤培养基中（Oxoid Ltd., Basingstoke, UK）。菌株在静置条件下孵育于
L. paracasei Zhang细胞可培养性的丧失
基于生长曲线实验，L. paracasei Zhang在对数生长期中期对环境胁迫表现出更高的敏感性，该生理状态有利于VBNC诱导，因此所有后续实验均使用此阶段收获的细胞。在所有测试的诱导条件下，120天期间可培养细胞数量均呈进行性下降（图1A）。
在较温和的胁迫条件（MRS肉汤培养基pH 5.0或6.0，或葡萄糖限制的MRS肉汤培养基，均为
讨论
已知细菌细胞可因各种环境胁迫而进入VBNC状态，包括渗透压失衡（Asakura et al., 2007）、营养剥夺（Cook & Bolster, 2007）和酸性条件（Cunningham et al., 2009）。在本研究中，已证实L. paracasei Zhang在MRS肉汤培养基中低温（4 °C）和酸性（pH 4.0）复合条件下可转变为VBNC状态，证据为在固体培养基上失去可培养性，同时保持
结论
Lacticaseibacillus paracasei Zhang在低温和酸性复合胁迫下转变为VBNC状态，其特征为失去可培养性，同时保持膜完整性和代谢活性。整合蛋白质组学分析揭示了一种协调性的适应性应答：PTS组分和丙酮酸分解代谢酶的上调维持最低限度的能量生成；氧化应激防御和DNA修复机制维持细胞完整性；以及全局性下调
CRediT作者贡献声明
包秋华（Qiuhua Bao）：撰写—审阅与编辑，撰写—初稿，项目管理，方法论，经费获取。高冉（Ran Gao）：撰写—初稿，可视化，验证，方法论，调查研究，形式化分析，数据整理。代丽霞（Lixia Dai）：验证，方法论，数据整理。李建安（Jianan Li）：可视化，软件，调查研究。袁宝怡（Baoyi Yuan）：方法论，形式化分析。张同舒（Tongshu Zhang）：软件，方法论。祁伟力（Weili Qi）：软件，方法论。Kwok Lai-Yu：撰写—审阅与
致谢
本研究得到国家自然科学基金（中国北京；项目编号32560552、31860434）、内蒙古自治区科技计划项目（中国呼和浩特；项目编号2025KYPT0107）、内蒙古自治区自然科学基金（中国呼和浩特；项目编号2023MS03046）以及内蒙古农业大学食品科学与工程学院科技计划项目（中国呼和浩特；项目编号SPKJ202205）的资助。经济支持
包秋华|高冉|代丽霞|李建安|袁宝怡|张同舒|祁伟力|Kwok Lai-Yu
