骨骼肌SH3BP2缺失导致神经肌肉接头异常和肌力下降：SH3BP2通过多价结合DGC与AChR五聚体调控突触后AChR聚集

《Frontiers in Molecular Neuroscience》：SH3BP2 deficiency in skeletal muscle leads to neuromuscular junction abnormalities and decreased muscle strength

　　

在神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ）突触后域，高密度乙酰胆碱受体（acetylcholine receptors, AChRs）的组装和稳定对于正常突触传递至关重要。在此，研究人员报道了一种支架蛋白SH3BP2的鉴定，该蛋白与抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合物（dystrophin-glycoprotein complex, DGC）和AChR五聚体表现出多价且直接的相互作用。培养肌管（myotubes）中的功能缺失（loss-of-function）实验显示，SH3BP2促进肌肉细胞中AChR组装体的形成。类似地，小鼠骨骼肌特异性SH3BP2缺失损害胚胎发育期间的AChR聚集，并在成年动物中引起多种NMJ形态和超微结构异常。突变小鼠还表现出突触传递、肌力和总体体能缺陷。该研究确定了SH3BP2在调节骨骼肌NMJ中的新作用。

研究背景与问题：NMJ是运动神经元与骨骼肌纤维之间的突触结构，其突触后域需维持高密度乙酰胆碱受体（AChRs）的组装与稳定。胚胎早期，肌纤维可自发形成AChR簇；运动轴突到达后选择性支配部分预模式AChR簇，未受支配簇逐渐消散。运动神经元通过乙酰胆碱（ACh）和agrin等调节突触后组织。agrin与Lrp4-MuSK复合物作用，引起MuSK依赖的下游磷酸化，包括Dok-7和AChR β亚基；AChR磷酸化为rapsyn提供结合位点，rapsyn结合AChRα并促进受体聚集。DGC是连接细胞外基质、膜蛋白和细胞骨架的跨膜复合物，其多个组分突变可导致严重肌营养不良。α-dystrobrevin-1（αDB1）是DGC胞质组分，在NMJ的AChR组织中重要，其突触功能依赖C端酪氨酸磷酸化，但分子机制尚不清楚。SH3BP2是一种支架蛋白，已知参与免疫和骨细胞信号调控，但其在骨骼肌中的定位和功能尚未被研究。因此，研究人员旨在解析SH3BP2在NMJ突触后机制中的作用。

关键技术方法概述：研究人员使用C2C12肌管，通过siRNA敲低SH3BP2，并以laminin-111或agrin诱导AChR聚集，结合荧光标记和免疫荧光分析。蛋白互作采用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, co-IP）、合成磷酸化/非磷酸化肽段沉淀、GST pull-down、双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation, BiFC）和质谱（mass spectrometry, MS）。动物模型为C57BL/6遗传背景，将Myf5-Cre与条件性SH3BP2 fl/fl小鼠杂交，产生骨骼肌特异性敲除（muscle-specific knockout, mKO）小鼠；分析E13.5、P15和成年NMJ，并进行电镜、行为学、肌力及电生理检测。样本来源包括Myf5-Cre小鼠、条件性SH3BP2敲除品系、HEK293细胞和C2C12细胞。

研究结果：
SH3BP2以磷酸化依赖方式与α-dystrobrevin-1相互作用：前期蛋白质组学提示SH3BP2为αDB1 Y⁷¹³磷酸化候选结合物。SH3BP2含N端pleckstrin homology（PH）域、中央SH3结合富脯氨酸区、C端Src homology 2（SH2）域及预测内在无序（ID）域。免疫染色显示SH3BP2富集于NMJ突触前和突触后区，并与AChR重叠；电转GFP-SH3BP2富集于NMJ。co-IP显示SH3BP2-FLAG共沉淀磷酸化αDB1-GFP；Y⁷¹³P肽直接沉淀纯化SH3BP2-MYC，而未磷酸化Y⁷¹³、Y⁷³⁰、Y⁷³⁰P肽及GST对照不沉淀；SH2域被Y⁷¹³P肽沉淀。BiFC在NMJ显示SH3BP2与αDB1相互作用。截短分析显示三个结构域均可靶向NMJ，但分布不同。结论：SH3BP2通过SH2域直接结合磷酸化Y⁷¹³αDB1，并在NMJ与αDB1互作；多个结构域参与其NMJ定位。

SH3BP2耗竭损害培养肌管中AChR聚集：在C2C12肌管中siRNA敲低SH3BP2后，laminin-111诱导的复杂AChR簇和总AChR簇均减少；agrin处理后的总AChR簇减少超过50%；表面和总AChR水平未见改变。结论：SH3BP2不影响AChR表达或表面运输，而促进其在质膜上的聚集能力。

SH3BP2与DGC复合物及AChR α和γ亚基相互作用：将纯化SH3BP2与C2C12肌管裂解物孵育，MS鉴定出AChR α/γ亚基、Lrp4、utrophin、dystrophin、α/β-syntrophin等。co-IP验证syntrophin-1、β-dystroglycan与SH3BP2互作；AChRγ胞质环和AChRα胞质环可共沉淀SH3BP2。AChRα胞质环肽段分析显示，全长SH3BP2被P1-P3沉淀；SH2域结合P1，富脯氨酸域结合P2，PH域结合P3，而rapsyn结合P3-P6。GST-cytAChRα与SH3BP2-FLAG直接互作；活肌管表面AChR可沉淀内源SH3BP2。结论：SH3BP2多价直接结合DGC组分和AChR，且其与AChRα的结合位点不同于rapsyn。

骨骼肌SH3BP2消融小鼠出现异常NMJ组织：研究人员生成SH3BP2 mKO小鼠，Western blot证实骨骼肌SH3BP2显著降低。运动神经元神经丝结构、轴突末梢数、分支点和轴突直径正常。成年Soleus NMJ更碎片化；终板面积正常，但AChR占据面积显著减少，穿孔面积增大；AChR与乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）错位约增加4倍；Tibialis anterior和diaphragm NMJ也更碎片化。E13.5 diaphragm中AChR热点更少、覆盖区域更小；P15时NMJ终板大小、AChR面积和突触穿孔减少。电镜显示突触后褶皱长度和厚度异常、突触后密度沿褶皱分布、突触间隙增宽。结论：SH3BP2缺失导致发育和成年NMJ形态及超微结构异常，AChR聚集和维持受损。

SH3BP2缺失导致肌力降低：mKO小鼠抓力降低，自愿跑轮距离减少，跑步机最大速度、运行时间和距离降低。Tibialis肌纤维横截面积和血清肌酸激酶（creatine kinase, CK）水平正常。结论：肌力下降并非源于肌纤维萎缩或损伤，而主要与神经肌肉缺陷相关。

SH3BP2 mKO小鼠神经肌肉传递受损：直接肌肉刺激时，单收缩力略降但未达显著，50和100 Hz强直力降低；坐骨神经刺激时，单收缩力和50、100、125 Hz强直力显著降低。膈肌复合肌肉动作电位（compound muscle action potential, CMAP）在1和5 Hz正常，50 Hz衰减增加。单纤维膜电阻正常；单刺激终板电位（endplate potential, EPP）幅度正常；5和20 Hz重复刺激时EPP衰减增加。结论：基础神经肌肉传递尚可，但高频和重复活动时突触效能维持存在缺陷。

讨论与结论：讨论指出，SH3BP2通过SH2域直接结合磷酸化αDB1，但SH2域并非其突触定位所必需；三个结构域均可靶向NMJ，提示SH3BP2与多个突触后组分发生多价互作。其与syntrophin-1、β-dystroglycan和αDB1互作，显示其多价结合DGC；同时直接结合AChRα，并以多价方式结合AChR五聚体。SH3BP2缺失使培养肌管AChR聚集减少而表面表达正常；E13.5神经支配前AChR热点形成受损；成年NMJ碎片化、AChR与AChE错位及超微结构异常。电生理显示基础传递完整，但重复刺激下传递缺陷，提示SH3BP2维持突触结构完整性以支持高频活动。行为学肌力下降而肌纤维完整、CK和膜电阻正常，支持NMJ特异性缺陷而非肌病。与某些DGC组分缺失导致肌营养不良不同，SH3BP2 mKO无肌营养不良症状，但突触褶皱异常。研究人员还提出，SH3BP2沿肌纤维呈条纹分布，类似DGC富集的costameres，可能具有突触外支架功能；其与podosome相关蛋白及Lrp4的互作提示NMJ中可能存在多重作用，尚待进一步研究。研究结论翻译：该研究确定了SH3BP2在调节骨骼肌神经肌肉接头中的新作用。