《Frontiers in Microbiology》：PF127 hydrogel-assisted in-situ Staphylococcus aureus biofilm fabrication endowing pathological animal model for chronic osteomyelitis
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摘要专业翻译
由生物膜驱动的慢性骨髓炎（chronic osteomyelitis, CO）难以治疗，因此其临床疗法与病理机制的探索在很大程度上依赖于有效的动物模型。然而，目前仍缺乏标准化且高效的方法来建立稳定、可重复的慢性骨髓炎动物模型。本研究开发了一种水凝
摘要专业翻译
由生物膜驱动的慢性骨髓炎（chronic osteomyelitis, CO）难以治疗，因此其临床疗法与病理机制的探索在很大程度上依赖于有效的动物模型。然而，目前仍缺乏标准化且高效的方法来建立稳定、可重复的慢性骨髓炎动物模型。本研究开发了一种水凝胶辅助原位生物膜构建（Hydrogel Assisted In-situ Biofilm Fabrication, HAIBF）方法，通过将温敏性Pluronic F-127（PF127）水凝胶与生物膜碎片偶联，稳定模拟生物膜感染的慢性骨髓炎病理过程。研究人员将48只大鼠随机分为四组：浮游菌注射组、直接生物膜注射组、PF127负载生物膜注射组和空白对照组。大鼠被处死后，于感染后一个月内每周采集胫骨样本一次。结合大体观察、扫描电子显微镜（SEM）、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、显微计算机断层扫描（micro-CT）三维重建及定量分析、苏木精-伊红（H&E）染色，综合评价生物膜定位、骨破坏及组织病理学改变。PF127促进了生物膜在骨组织内的稳定定位。综上，这些结果验证了以持续性生物膜感染、病理性骨重塑和骨修复受损为特征的慢性骨髓炎模型的成功建立。HAIBF方法将低代谢生物膜碎片与可注射、温敏响应的PF127水凝胶相结合，建立了一种无植入物骨感染模型，该模型可在原位发生凝胶化并促进生物膜来源物质在局部的滞留。在相对较短的感染进展期内，该模型能够可靠地再现持续性生物膜相关感染及慢性骨髓炎的部分病理特征，从而为机制研究和治疗评估提供一个更稳定、更一致的实验平台。
论文解读
一、研究背景与目的
慢性骨髓炎（chronic osteomyelitis, CO）是一种由生物膜驱动的难治性骨感染，具有高复发率（高达33%）和沉重的治疗负担，是骨科临床面临的重大挑战。生物膜是细菌附着于表面后分泌胞外聚合物（extracellular polymeric substance, EPS）形成的结构化群落，其低代谢状态和物理屏障特性使得传统抗生素难以彻底清除，导致感染迁延不愈。因此，建立能够精确模拟慢性骨髓炎慢性化和复发性病理过程的可靠动物模型，对于探索其发病机制和开发新型治疗策略至关重要。
然而，现有慢性骨髓炎动物模型的建立方法存在明显局限。传统的浮游菌悬液注射法操作简便，但存在慢性感染特征不稳定、生物膜形成不均匀等问题，难以保证模型的重复性。基于生物膜负载植入物的模型虽然能模拟内固定装置相关的感染场景，但植入物本身的性质和处理方式会显著影响感染进程、骨愈合和治疗反应，干扰模型结果的解读；同时，外源引入生物膜的大小难以控制，过高的局部细菌负荷容易诱发急性感染而非稳定的慢性感染。因此，亟需一种既能稳定引入生物膜、又能避免急性感染和过早清除的新型模型建立策略。
针对上述问题，本研究开发了一种水凝胶辅助原位生物膜构建（HAIBF）方法，利用温敏性Pluronic F-127（PF127）水凝胶作为偶联载体，将预制的生物膜碎片包裹并在骨缺损部位原位凝胶化，从而实现生物膜在靶部位的稳定滞留和持续释放，以期建立更稳定、可重复的慢性骨髓炎动物模型。
二、主要技术方法
研究人员采用以下关键技术手段开展研究。首先，通过试管倒置法和动态振荡流变学测试表征PF127的温敏凝胶化行为，筛选适宜的浓度和凝胶化温度。其次，通过皮下注射实验评估PF127在体内的降解速率。再次，采用纸片扩散法和活/死细胞染色评估PF127的抗菌活性和细胞相容性。随后，培养金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, ATCC 25923）生物膜并制备50–100 μm的生物膜碎片，与15%（w/v）PF127溶液按1:1混合制成复合接种物。动物实验选用48只8周龄雄性SD大鼠（250–300 g，购自南京君科生物科技有限公司），随机分为浮游菌注射组、生物膜碎片注射组、HAIBF复合物注射组和生理盐水空白对照组，每组12只，于胫骨近端骨髓腔注射100 μL接种物。术后第7、14、21、28天分批处死动物取材，结合大体病理观察、SEM、CLSM、micro-CT三维重建与定量分析及H&E染色综合评价模型效果。
三、研究结果
3.1 PF127水凝胶的物理特性与生物相容性
研究人员通过试管倒置法证实，10%–20%（w/v）的PF127溶液在4°C呈液态，升温至35 ± 2°C临界凝胶化温度（critical gelation temperature, CGT）后迅速转变为半固态凝胶。流变学测试显示，15%（w/v）PF127的CGT为35.1°C，符合大鼠体温条件，凝胶态储能模量（G′）约为937.9 Pa。体内降解实验表明，皮下注射的PF127凝胶在第3天缩小至约4 mm，第6天已无法肉眼检测，且注射部位未见明显炎症反应。PF127对预制生物膜的总生物量无显著影响，对金黄色葡萄球菌无抑菌活性，与骨髓间充质干细胞共培养后细胞活力超过96%，证实其良好的生物相容性。
3.2 动物行为观察
所有接种组模型动物均表现出活动意愿降低、摄食减少和不同程度的跛行，但均能自由活动并承重。浮游菌注射组有1只动物在观察期内发生病理性骨折。所有动物体重下降均未超过术前基线的20%。
3.3 大体病理表现与死亡率
浮游菌注射组有1只大鼠于第3天死亡，可能死于急性感染。浮游菌和生物膜注射组在术后第3天即出现皮肤红肿、皮下脓肿，第14天后感染征象消失。HAIBF组在术后前7天无明显感染表现，此后逐渐出现皮肤发红，第14天出现脓疱、皮肤溃疡和脓性分泌物，并在第4周仍持续存在，呈现更持久的感染过程。
3.4 共聚焦与扫描电子显微镜观察
CLSM显示，HAIBF组骨缺损部位的金黄色葡萄球菌相关荧光信号更密集且分布均匀，而浮游菌和生物膜组荧光信号较为分散。SEM观察发现，HAIBF组在第7天和第14天均可见聚集性生物膜样结构，第2周时形成被EPS包裹的多层细胞增厚生物膜，而其他接种组仅见散在的细菌附着，无明显生物膜形成。
3.5 Micro-CT扫描结果
三维重建显示，空白对照组骨皮质完整、骨小梁结构规则。浮游菌和生物膜组呈现严重溶骨性病变，髓腔扩大、骨小梁大量丢失。HAIBF组则表现为骨小梁增厚、排列紊乱。定量分析显示，与空白对照组相比，三个接种组的骨小梁数量（trabecular number, Tb.N）分别降低62.56%、56.14%和42.3%；浮游菌和生物膜组的骨小梁厚度（trabecular thickness, Tb.Th）分别降低51.92%和45.91%，而HAIBF组Tb.Th反而增加22.9%。HAIBF组的骨密度（bone mineral density, BMD）和骨体积分数（bone volume fraction, BV/TV）降低幅度（分别为8.39%和5.91%）小于其他接种组。此外，HAIBF组的结构模型指数（structural model index, SMI）显著降低，而浮游菌和生物膜组SMI升高；三个接种组的连接密度（connectivity density, Conn.D）均下降。这些结果提示HAIBF组呈现独特的感染相关骨微结构改变模式，区别于单纯的溶骨性破坏。
3.6 H&E染色结果
组织学分析显示，空白对照组无炎症细胞浸润和髓腔坏死。浮游菌和生物膜组在髓腔内可见大量中性粒细胞聚集和广泛骨小梁丢失。HAIBF组在骨缺损邻近区域可见类骨质样基质和成骨样细胞，伴有局灶性淋巴细胞浸润和死骨包绕，符合慢性炎症环境下持续骨重塑的特征，且第4周时死骨和淋巴细胞浸润的病理特征持续存在。
四、讨论与结论
讨论部分指出，传统的浮游菌接种法难以保证生物膜的一致形成和稳定分布，而生物膜负载植入物法可能因植入物干扰和细菌负荷过高而导致急性感染。HAIBF方法通过PF127的温敏凝胶化实现生物膜碎片的原位固定和缓释，50–100 μm的碎片尺寸超出巨噬细胞吞噬上限（约20–30 μm），有助于避免早期清除，延长慢性感染持续时间。多种表征手段证实，HAIBF组在3周内即出现死骨形成、淋巴细胞浸润和异常骨重塑等慢性骨髓炎核心病理特征，而传统方法建立的模型在第3周时感染已趋于消退。该方法显著缩短了模型建立周期，提高了模型的稳定性和可重复性，为慢性骨髓炎的机制研究和治疗策略评估提供了可靠的实验平台。
研究结论为：本研究开发的HAIBF方法通过将温敏性PF127水凝胶与生物膜碎片偶联，稳定模拟了生物膜感染的慢性骨髓炎病理过程。利用PF127的柔软性和良好生物相容性，该方法促进了细菌在骨组织中的稳定定植，成功建立了模型建立周期短、稳定性高、可重复性好的慢性骨髓炎模型，为骨科感染研究领域的病理机制探索和创新治疗策略开发提供了可靠的动物平台。
