急性期脑脊液可溶性TIM-3和半乳糖凝集素-9与AQP4-IgG阳性视神经脊髓炎谱系疾病患者6个月残疾严重程度相关

《Frontiers in Immunology》：Soluble TIM-3 and galectin-9 in cerebrospinal fluid are associated with disability at 6 months in aquaporin-4 IgG-positive neuromyelitis optica spectrum disorder

　　

背景：视神经脊髓炎谱系疾病（neuromyelitis optica spectrum disorders, NMOSD）是中枢神经系统严重自身免疫性疾病，其特征为针对aquaporin 4的自身抗体（AQP4-IgG）。尽管已有若干分子靶向治疗，但能够在急性复发期早期预测后续残疾的生物标志物仍不足。鉴于免疫检查点分子异常已知参与自身免疫，本研究探讨急性期AQP4-IgG阳性NMOSD患者脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）中免疫检查点相关分子是否与6个月时残疾相关。方法：纳入34例AQP4-IgG阳性NMOSD患者、10例疾病发作期髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体相关疾病（myelin oligodendrocyte glycoprotein antibody-associated disease, MOGAD）患者，以及11例特发性正常压力脑积水（idiopathic normal pressure hydrocephalus, iNPH）作为非炎症性神经系统疾病对照。采用基于微球的多元免疫检测定量CSF中免疫检查点分子及相关因子（程序性死亡受体1[PD-1]、程序性死亡配体1[PD-L1]、细胞毒性T淋巴细胞抗原4[CTLA-4]、T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域3[TIM-3]、半乳糖凝集素-9[galectin-9]、淋巴细胞激活基因3[LAG-3]、4-1BB、B7.2、白介素-2受体α链[IL-2Rα]、转化生长因子β₁[TGF-β₁]、Fas配体[FasL]）水平。这些分子在可溶性组分中测定。6个月疾病严重程度分为轻度（扩展残疾状况量表[EDSS] < 6）或重度（EDSS ≥ 6）。进行受试者工作特征（ROC）分析评估预后效能。结果：26例NMOSD表现为轻度残疾，8例为重度残疾。所有MOGAD病例均表现为轻度残疾。与轻度组相比，重度组年龄更高、男性比例更高、CSF蛋白水平更高（分别为p=0.004、p=0.017、p<0.001）。重度组CSF中TIM-3、galectin-9和IL-2Rα水平显著更高（分别为p=0.011、p=0.008、p=0.006），受试者工作特征曲线下面积值分别为0.89、0.88和0.80。结论：在AQP4-IgG阳性NMOSD患者中，急性发作期CSF中TIM-3、galectin-9和IL-2Rα水平升高与6个月时残疾严重程度恶化相关。这些发现提示其作为早期预后生物标志物的潜力，但仍需在大型队列中验证。

研究背景方面，视神经脊髓炎谱系疾病（neuromyelitis optica spectrum disorders, NMOSD）是主要累及视神经和脊髓的中枢神经系统（central nervous system, CNS）自身免疫性疾病，以抗aquaporin 4自身抗体（AQP4-IgG）为特征并参与发病。尽管靶向治疗出现后预后有所改善，但总体预后仍差，因此早期治疗和按严重程度预防复发至关重要。目前虽已有分子靶向治疗，但尚无在NMOSD急性期预测严重程度的生物标志物。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体相关疾病（myelin oligodendrocyte glycoprotein antibody-associated disease, MOGAD）是CNS新兴自身免疫性疾病，与NMOSD临床表型可比。免疫检查点分子调节CNS自身反应性T细胞。既往研究曾报告血清程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1, PD-1）/程序性死亡配体1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）水平与NMOSD复发相关，另一研究提示血清淋巴细胞激活基因3（lymphocyte activation gene 3, LAG-3）表达与NMOSD严重程度负相关，但这些预后预测因子在NMOSD和MOGAD中的价值尚未完全确立。脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）免疫检查点分子反映神经免疫调节，可能与NMOSD、MOGAD等神经免疫疾病严重程度相关。为此，研究人员开展本研究，旨在确定神经免疫疾病中CSF免疫检查点分子是否与未来残疾相关。研究结论提示，在AQP4-IgG阳性NMOSD患者中，急性发作期CSF中T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域3（T-cell immunoglobulin and mucin domain 3, TIM-3）、半乳糖凝集素-9（galectin-9）和IL-2Rα（interleukin-2 receptor chain alpha，白介素-2受体α链）升高与6个月时残疾严重程度恶化相关，提示其作为早期预后生物标志物的潜力，但仍需大型队列验证。

关键技术方法方面，研究人员进行回顾性队列研究，样本来自Kobe University 2015年1月至2025年3月治疗患者。纳入标准为年龄≥18岁且具有可分析CSF样本者；共纳入34例AQP4-IgG阳性NMOSD、10例疾病发作期MOGAD、11例特发性正常压力脑积水（idiopathic normal pressure hydrocephalus, iNPH）作为非炎症性神经系统疾病对照。NMOSD和MOGAD按既定诊断标准诊断，iNPH按既定指南诊断为可能iNPH。NMOSD按6个月扩展残疾状况量表（expanded disability status scale, EDSS）分为轻度（EDSS < 6）和重度（EDSS ≥ 6）。NMOSD和MOGAD的CSF在复发发生后3个月内采集。采用基于微球的多元免疫检测定量CSF上清中可溶性PD-1、PD-L1、细胞毒性T淋巴细胞抗原4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4, CTLA-4）、TIM-3、galectin-9、LAG-3、4-1BB、B7.2、IL-2Rα、转化生长因子β₁（transforming growth factor β₁, TGF-β₁）、Fas配体（Fas ligand, FasL）。统计分析使用Fisher精确检验、Kruskal-Wallis及Dunn检验、Brunner-Munzel检验、受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线及曲线下面积（area under the curve, AUC），使用R 4.4.1与RStudio 2022.07.2。

研究结果方面：

Clinical and CSF features of NMOSD patients：通过比较NMOSD、MOGAD和iNPH组间及轻度和重度NMOSD组间的人口学、临床和CSF特征，研究人员发现年龄在组间差异显著，事后分析显示iNPH年龄最高，其次为NMOSD和MOGAD；重度NMOSD患者显著重于轻度NMOSD。性别总体差异存在，NMOSD女性多于MOGAD；重度NMOSD男性比例高于轻度NMOSD。CSF白细胞计数差异显著，NMOSD和MOGAD高于iNPH。重度NMOSD的CSF蛋白水平高于轻度NMOSD。26例NMOSD为轻度残疾，8例为重度残疾；所有MOGAD均表现为轻度残疾。重度NMOSD预处理EDSS高于轻度NMOSD。

CSF TIM-3 and galectin-9 were associated with poor outcome for NMOSD：通过比较各组CSF标志物，研究人员发现TIM-3、galectin-9、IL-2Rα、LAG-3、B7.2和FasL在组间差异显著；事后分析显示，重度NMOSD中TIM-3、galectin-9和IL-2Rα水平显著高于其他组。其他标志物对重度NMOSD与其他组的区分能力有限，所有标志物区分MOGAD与iNPH的能力均减弱。ROC分析显示CSF TIM-3和galectin-9具有良好区分效能，IL-2Rα为中等预后准确性；TIM-3、galectin-9和IL-2Rα的AUC分别为0.894（95% CI，0.772-1.0）、0.880（95% CI，0.709-1.0）和0.798（95% CI，0.612-0.985）。在预处理EDSS ≥ 6的探索性分析中，3例患者6个月EDSS < 6并归入轻度组；恢复良好者CSF TIM-3和galectin-9水平显著低于持续重度残疾者。

CSF TIM-3 and galectin-9 were correlated in NMOSD：通过相关分析，研究人员发现TIM-3与galectin-9呈强正相关（ρ=0.85，p<0.001）；IL-2Rα与TIM-3或galectin-9呈中等相关（TIM-3 vs IL-2Rα：ρ=0.53，p=0.001；galectin-9 vs IL-2Rα：ρ=0.64，p<0.001）。相关性矩阵进一步显示这些CSF预后标志物之间的Spearman秩相关系数。

讨论部分总结：该回顾性单中心研究使用基于微球的多元免疫检测探讨神经免疫疾病CSF预后标志物，新发现重度NMOSD患者CSF TIM-3和galectin-9显著升高。既往报道NMOSD患者外周血单核细胞中TIM-3倾向高表达，因此CSF中TIM-3/galectin-9可能成为与NMOSD疾病严重程度相关的新生物标志物。既往血清可溶性PD-1/PD-L1与AQP4-IgG阳性NMOSD疾病状态或未来复发相关，外周血LAG-3表达与疾病严重程度相关，这些发现支持免疫检查点通路参与NMOSD。CSF测量可更直接采样CNS腔室，但CSF浓度本身不能区分鞘内产生与血-CSF屏障破坏相关被动转移，因此需配对血清-CSF研究确定CSF生物标志物相对系统性测量的增量价值。基线临床严重程度混杂也应考虑：6个月严重残疾者预处理EDSS显著更高，提示初始发作严重程度可能促成后续残疾。由于仅8例6个月重度残疾，未进行多变量回归分析，因调整多个临床和生物标志物变量可能导致模型不稳定和过拟合；小样本结局事件所得ROC估计可能不稳定并可能被高估，应视为探索性估计而非决定性预后区分指标。研究不能确立CSF TIM-3或galectin-9在基线残疾和临床特征之外提供独立预后信息，也不能确定将其加入常规临床变量尤其预处理EDSS是否改善预后区分。预处理EDSS ≥ 6的探索性分析中，改善至6个月EDSS < 6者CSF TIM-3和galectin-9低于持续严重残疾者，但样本量小，不能对其独立预后价值作确定结论。TIM-3是与galectin-9结合的免疫检查点分子，促进T细胞耗竭并参与CNS免疫调节；galectin-9由活化星形胶质细胞分泌，已知以TIM-3依赖方式抑制自身反应性T细胞，也以TIM-3非依赖方式增强小胶质细胞细胞因子分泌。TIM-3/galectin-9作用随细胞类型、病理状态和疾病阶段变化，其在CNS中的功能尚未完全阐明。已有报道原发中枢神经系统淋巴瘤（primary central nervous system lymphoma, PCNSL）患者CSF中TIM-3和galectin-9升高，PCNSL组织中TIM-3高表达于肿瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞和淋巴细胞，galectin-9高表达于肿瘤相关巨噬细胞、胶质细胞和内皮细胞；阿尔茨海默病模型小鼠小胶质细胞中TIM-3/galectin-9高表达，因此CSF中TIM-3/galectin-9可能并非来自单一细胞类型，而可能作为反映CNS内胶质激活的生物标志物。NMOSD急性期组织破坏中可见活化中性粒细胞、巨噬细胞及T细胞；TIM-3/galectin-9信号在T细胞中起抑制作用，TIM-3也表达于固有免疫细胞，并已知通过galectin-9诱导固有免疫系统激活如中性粒细胞脱颗粒。TIM-3与galectin-9强相关提示TIM-3/galectin-9轴可能与固有免疫激活和NMOSD疾病严重程度相关。MOGAD病例CSF TIM-3和galectin-9较低且临床病程轻，与当前认为MOGAD较NMOSD轻的认识一致。由于仅测量CSF中可溶性TIM-3和galectin-9，未评估免疫或其他细胞群上的细胞表面或膜结合表达，因此不能确立细胞水平TIM-3/galectin-9信号通路激活，其细胞来源和升高机制仍不清楚；CSF升高可能反映鞘内免疫活动、活化细胞释放或脱落，或与血-CSF屏障破坏相关被动转移。未来需纳入细胞分析（包括细胞表面表达）、配对血清-CSF测量及血-CSF屏障完整性标志物以阐明这些可溶性分子的生物学意义和来源。IL-2Rα显示中等预后效能，且与TIM-3和galectin-9仅中等相关；这种差异模式可能反映这些分子代表的生物学过程不同。IL-2Rα主要反映通过IL-2受体信号介导的T细胞激活和增殖，而TIM-3和galectin-9构成不同的免疫检查点轴，因此IL-2Rα可能提供关于炎症性淋巴细胞激活的补充信息，而非直接反映TIM-3/galectin-9通路激活。局限性包括：回顾性单中心研究、样本量相对小，尤其6个月重度残疾者仅8例；因结局事件有限未做多变量回归，无法确定CSF TIM-3和galectin-9在校正基线EDSS、年龄、性别、CSF蛋白水平及其他潜在混杂因素后是否独立相关；探索性分析样本量极小；回顾性队列未一致获得与CSF同时采集的配对血清，无法直接比较CSF和血清浓度，也无法确定CSF升高主要反映系统性还是鞘内免疫反应。未来需前瞻性队列、足够样本量、适当校正基线临床变量，并在标准化时间点采集配对血清和CSF。

研究结论翻译：在AQP4-IgG阳性NMOSD中，急性发作期CSF中TIM-3和galectin-9水平较高与6个月时严重残疾相关。这些发现提示TIM-3和galectin-9可能是与临床结局相关的候选生物标志物。然而，其独立预后价值和临床效用仍不确定。在这些生物标志物可考虑用于常规临床之前，需要大型前瞻性多中心研究，并采用标准化临床评估和配对血清-CSF检测。