《Frontiers in Immunology》：Identification of psoriasis-associated hub genes by integrated transcriptomics and machine learning
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本研究旨在通过整合生物信息学（bioinformatics）、机器学习（machine learning）和实验验证（experimental validation）方法，系统识别银屑病（psoriasis）发病机制中的关键枢纽基因（hub genes）。从基
本研究旨在通过整合生物信息学（bioinformatics）、机器学习（machine learning）和实验验证（experimental validation）方法，系统识别银屑病（psoriasis）发病机制中的关键枢纽基因（hub genes）。从基因表达综合数据库（GEO）检索四个银屑病微阵列数据集，通过比较分析识别差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）。采用双重机器学习方法筛选核心枢纽基因，并在独立队列中验证其表达水平和诊断效能。采用CIBERSORT进行免疫细胞浸润（immune cell infiltration）分析，同时通过多数据库方法构建mRNA-miRNA-lncRNA调控网络。应用分子对接（molecular docking）技术评估环境污染物双酚A（bisphenol A, BPA）、预测药物与枢纽基因之间的相互作用。最后，通过M5细胞因子混合物（M5 cytokine mixture）刺激HaCaT细胞建立体外银屑病模型，并通过实时定量PCR（RT-qPCR）验证枢纽基因表达。结果显示，在银屑病中识别出77个共差异表达基因。机器学习筛选出五个关键枢纽基因：CARHSP1、HPSE、PCLAF、SERPINB4和SPRR2C。这些基因在验证队列中显著上调，并对区分银屑病皮损皮肤与配对非皮损皮肤表现出强区分价值，而非作为银屑病的独立诊断生物标志物。免疫细胞浸润分析揭示其与包括T细胞和巨噬细胞在内的免疫亚群广泛相关。分子对接计算预测环境污染物BPA与枢纽基因HPSE之间存在潜在结合相互作用，尚待未来实验验证。同时，染料木黄酮（Genistein）与HPSE被提示存在潜在相互作用，尚待功能验证。体外实验证实，在M5诱导的银屑病细胞模型中，HPSE、PCLAF和SPRR2C的mRNA水平显著上调。HPSE表现为与免疫失调相关的多功能核心基因。分子对接额外预测环境污染物BPA与HPSE之间存在潜在相互作用；然而，该相互作用仍为计算假设，需要实验验证。
银屑病（psoriasis, PSO）是一种免疫介导的遗传性疾病，可累及皮肤和/或关节，以持续性炎症和皮肤细胞过度增殖为特征。该病全球分布，任何年龄均可发病，给患者和社会带来显著负担。其亚型包括斑块状、点滴状、脓疱型和红皮病型，其中斑块状最常见。患者常见疼痛、瘙痒和出血；当皮损广泛或累及面部、掌跖和生殖器等关键部位时，对生活质量和心理影响尤为明显。尽管已有局部治疗、光疗、口服系统治疗和生物制剂等选择，但银屑病仍无法治愈。患者血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17A和IL-18等促炎细胞因子升高，针对关键细胞因子的生物制剂已进入临床。然而，由于银屑病具有多靶点、多通路发病机制，单一生物制剂难以达到最优疗效，且治疗存在不同程度副作用。因此，研究人员旨在通过分析银屑病相关整合基因表达数据集（GEO），识别银屑病与健康对照之间的差异表达基因（DEGs），并结合Gene Ontology（GO）富集、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析和机器学习，预测并验证与银屑病相关的五个关键基因和通路，为治疗提供新视角和靶点。
研究人员从GEO数据库下载GSE13355、GSE34248、GSE41662和GSE166388作为训练集。其中GSE13355和GSE166388比较银屑病皮损与健康正常皮肤（NN），GSE34248和GSE41662比较皮损与配对非皮损皮肤（NL）。GSE30999作为独立验证集，包含85例中重度银屑病患者配对皮损和非皮损皮肤，不含健康对照皮肤。研究人员交叉核对验证集与训练集的样本登录号和患者元数据，确认无样本重叠。采用严格交集策略，最终识别77个共DEGs，包括70个上调和7个下调基因。通过最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归和支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）双机器学习方法，从77个基因中筛选出五个核心枢纽基因：CARHSP1、HPSE、PCLAF、SERPINB4和SPRR2C。这些基因在验证集中显著上调，对区分皮损与非皮损具有强区分价值，曲线下面积（AUC）均超过0.9，但应解释为皮损分离指标，而非银屑病独立诊断生物标志物。免疫细胞浸润分析显示其与T细胞、巨噬细胞等免疫亚群广泛相关。分子对接预测环境污染物BPA与HPSE存在潜在结合，尚待实验验证；同时提示Genistein与HPSE潜在相互作用。体外实验证实HPSE、PCLAF和SPRR2C在M5诱导的银屑病细胞模型中显著上调。研究表明HPSE是关联免疫失调的多功能核心基因，并构建了连接遗传易感性、免疫失调、环境暴露和靶向治疗的综合框架。
关键技术方法：使用GEO训练队列GSE13355、GSE34248、GSE41662、GSE166388，独立验证队列GSE30999（85例中重度银屑病配对皮损/非皮损）。采用limma行差异表达分析；GO/KEGG富集；LASSO与SVM-RFE筛选；ROC/AUC及bootstrap评估；CIBERSORT免疫浸润；多数据库构建mRNA-miRNA-lncRNA网络；分子对接；M5诱导HaCaT细胞模型，RT-qPCR验证枢纽基因。
结果部分：
Differential expression analysis of psoriasis-associated genes：研究人员对四个训练数据集进行差异分析，以|logFC|>1且校正P<0.05为筛选标准，分别获得505、526、868、384个上调DEGs和292、428、543、150个下调DEGs；四个数据集严格交集得到70个上调、7个下调共表达基因。
Intersection target enrichment analysis：GO富集显示交集基因涉及基因转录调控、细胞代谢、免疫应答和细胞周期等生物学过程，细胞组分涉及细胞核、内质网、细胞膜等，分子功能涉及ATP酶活性、RNA结合、蛋白受体结合等；KEGG富集于丙型肝炎、EB病毒（EBV）感染、麻疹、细胞周期、p53信号通路和卵母细胞成熟等。
Machine learning analysis of hub targets：以77个交集DEGs为输入特征，LASSO回归筛选出含KLK8、CMAHP、CDHR1、SYNCRIP、SLC16A1、HERC6、CARHSP1等44个特征基因，SVM-RFE筛选出CARHSP1、CD24、CKS2、HPSE、IRF7、KIF20A、PCLAF、RRM2、SERPINB4和SPRR2C，两者交集得到五个枢纽基因。
Validation of hub genes：在GSE30999中，CARHSP1、PCLAF、SERPINB4、HPSE和SPRR2C在皮损中显著上调（P<0.05），AUC均超过0.9；bootstrap估计分别为CARHSP1 0.973、HPSE 0.986、PCLAF 0.948、SERPINB4 0.982、SPRR2C 0.970，表明对中重度银屑病皮损与非皮损有强区分能力，但不代表对健康皮肤或其他炎症性皮肤病诊断性能。
Predicted mRNA-miRNA-lncRNA regulatory network：研究预测HPSE关联119个miRNA和965个lncRNA，CARHSP1关联73个miRNA和628个lncRNA，PCLAF关联42个miRNA和216个lncRNA，SERPINB4关联29个miRNA和77个lncRNA，SPRR2C未检测到对应miRNA；该网络仅基于靶点预测数据库，未用银屑病组织miRNA/lncRNA表达数据验证。
Analysis of immune cell infiltration：CIBERSORT分析显示银屑病皮损中CD4
+记忆活化T细胞、γδ T细胞、静息自然杀伤（NK）细胞、M1巨噬细胞和活化树突状细胞浸润增加，而记忆B细胞、浆细胞、活化NK细胞和静息肥大细胞减少。
Immune infiltration correlation of core genes：五个核心基因与22类免疫细胞浸润评分相关，110项检验中56项未校正P<0.05，47项经错误发现率（FDR）校正后q<0.05；五个基因均与活化树突状细胞、活化CD4
+记忆T细胞和M1巨噬细胞正相关，与静息肥大细胞、活化NK细胞等负相关。
Pharmacological effects：MalaCards显示394种现有银屑病治疗，168种获批临床，39种处于4期；DGIdb预测HPSE对应18个化合物，其他枢纽基因未识别对应药物；分子对接显示HPSE与Genistein结合亲和力强，氢键数最高、结合能最低、构象稳定。
The environmental endocrine disruptor bisphenol A (BPA) exerts pathogenic effects on psoriasis via HPSE：分子对接显示BPA与HPSE结合能为-5.35 kcal/mol，形成2个氢键，弱于AMOPYROQUINE的-6.65 kcal/mol和Genistein的-6.78 kcal/mol；该结果仅提示BPA具有与HPSE相互作用的计算潜力。
RT-qPCR validation of hub genes：M5刺激HaCaT细胞后，IL-1β、IL-6、IL-8、S100A8/9和KRT6 mRNA升高，KRT10降低，提示模型成功；HPSE、PCLAF和SPRR2C显著上调，与预测一致，CARHSP1和SERPINB4无显著差异。
讨论部分总结：KEGG病毒通路富集反映I型干扰素（IFN）反应和抗病毒限制因子与银屑病炎症共享，并非非特异病毒病因。HPSE参与细胞外基质（ECM）降解和硫酸乙酰肝素（HS）释放，在炎症部位表达，Lerner I等提示其介导免疫细胞与上皮细胞异常相互作用。BPA作为内分泌干扰物，环境暴露与自身免疫病包括银屑病有关，可激活炎症小体和干扰素信号，其弱雌激素特性可能通过HPSE参与致病，但统一模型仍属推测。Genistein为异黄酮/植物雌激素和选择性雌激素受体调节剂（SERM），可结合HPSE，也可竞争雌激素受体下调HPSE，并具有抗银屑病和抗炎作用。PCLAF与增殖细胞核抗原（PCNA）相互作用，参与DNA修复、复制和细胞增殖，与角质形成细胞过度增殖一致。SPRR2C编码lncRNA，参与角质形成细胞分化和皮肤屏障形成，可通过miR-330/STAT1/S100A7轴调节IL-22刺激的HaCaT细胞表型，表皮分化复合物（EDC）表观遗传重塑可能参与其过表达。CARHSP1属于冷休克结构域（CSD）蛋白家族，可结合IL-17受体A（IL-17RA）mRNA；SERPINB4是IL-22和IL-17下游分子。M5单培养模型缺乏免疫细胞和动态基质-免疫互作，可能解释CARHSP1和SERPINB4未在体外显著上调。研究局限包括公共转录组数据、CIBERSORT固有局限、相关性非因果、机制未明、M5模型局限、缺乏PASI等临床元数据、仅mRNA水平验证、训练集对照异质、严格交集非正式meta分析、ceRNA网络未表达验证、BPA-HPSE仅计算预测等。
研究结论翻译：本研究通过整合生物信息学、机器学习和实验验证，系统识别了五个银屑病核心枢纽基因——CARHSP1、HPSE、PCLAF、SERPINB4和SPRR2C。这些基因对已形成银屑病皮损表现出强区分价值，并与免疫浸润、细胞周期活性和皮肤屏障改变相关。然而，当前数据支持其作为皮损相关标志物，而非疾病起始的已证实驱动因素。研究进一步构建了mRNA-miRNA-lncRNA调控网络，通过计算对接预测环境污染物BPA可能结合HPSE。这提示一种潜在环境致病机制，需在未来研究中严格实验验证。同时，计算对接预测抗雌激素药物作为HPSE靶向候选药物的潜力，但缺乏实验验证。这建立了一个连接遗传易感性、免疫失调、环境暴露和靶向治疗的综合致病框架，为未来研究银屑病皮损相关生物标志物和靶向治疗策略提供了框架，同时承认当前证据支持所识别基因的关联性而非因果性。
