α-半乳糖神经酰胺作为mRNA疫苗佐剂调节抗结核细胞免疫，并通过prime-pull策略促进携带组织驻留记忆相关表型的肺相关抗原特异性T细胞

《Frontiers in Immunology》：Alpha-galactosylceramide as mRNA vaccine adjuvant modulates cellular immunity against tuberculosis and contributes to antigen-specific lung-associated T cells with a TRM-associated phenotype following prime-pull strategy

　　

摘要专业翻译 结核病（Tuberculosis, TB）仍然是全球由单一传染性病原体导致死亡的首要原因，凸显了在卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin, BCG）疫苗目前提供的有限保护之外，开发改良疫苗的迫切需求。本研究探讨了将α-半乳糖神经酰胺（alpha-Galactosylceramide, αGC）纳入mRNA脂质纳米颗粒（mRNA lipid nanoparticles, mRNA-LNPs）作为针对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）疫苗策略的免疫学影响。研究人员利用Mtb抗原ESAT-6和Ag85B，证明αGC佐剂化的mRNA-LNPs可诱导不变自然杀伤T（invariant natural killer T, iNKT）细胞的受控激活，从而重塑疫苗诱导的免疫。具体而言，αGC的纳入促进了脾脏中CD44+CD69+CD62L-CD4+ T细胞的生成，并通过在强效TH1免疫基础上叠加适度的TH2和TH17应答，改变了CD4+ T辅助（TH）细胞谱型。此外，仅在遗传多样化的CB6F1/J小鼠模型中观察到针对ESAT-6和Ag85B的抗原特异性CD8+ T细胞应答，凸显了宿主遗传背景在同源疫苗接种策略后评估mRNA疫苗免疫原性的重要性。最后，研究人员证明，采用将肌内mRNA疫苗接种与局部抗原滴注相结合的异源prime-pull策略，可增加肺相关抗原特异性CD4+ T细胞的频率，这些细胞呈现组织驻留相关表型，且αGC佐剂化对该应答具有额外贡献。综上所述，这些发现为αGC佐剂介导的mRNA疫苗免疫调节提供了新见解，并支持进一步测试该方法针对结核病的保护效力。

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一、研究背景与意义

结核病（Tuberculosis, TB）由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起，至今仍是全球因单一传染性病原体导致死亡的首要原因。根据世界卫生组织（WHO）最新报告，2024年全球估计有1070万人罹患结核病，相关死亡人数达123万。HIV共感染和耐多药（MDR）菌株的出现进一步加重了全球结核病负担。目前唯一获许可的疫苗——减毒牛分枝杆菌菌株卡介苗（BCG），对儿童粟粒性和脑膜性结核能提供可靠保护，但对成人肺结核的保护效力低且高度可变。鉴于WHO提出2035年终止结核病流行的宏伟目标，全球正大力推进改良结核病疫苗候选品的开发，目前已有17个候选疫苗处于临床开发阶段。

2020年COVID-19大流行加速了mRNA疫苗技术的发展，确立了其作为下一代疫苗平台的广阔前景。mRNA疫苗具有良好的安全性特征，并能有效诱导体液免疫和系统性CD8⁺ T细胞应答及多功能性CD4⁺ T细胞。BioNTech已推进两个编码八种Mtb抗原的多价临床候选疫苗BNT164a1和BNT164b1进入临床试验，多项临床前研究也证实了mRNA疫苗针对Mtb的保护效力。

长期以来，IFN-γ分泌型CD4⁺ T_H1细胞和IL-17分泌型T_H17细胞被认为是结核病疫苗开发中的主要效应细胞类型。然而，近期研究揭示了CD8⁺ T细胞及非常规T细胞（如γδ T细胞、iNKT细胞、NK细胞和黏膜相关恒定T（MAIT）细胞）在Mtb感染早期控制中的重要作用。此外，肺组织驻留记忆T（T_RM）细胞被认为是Mtb早期控制的关键介质，在诱导无菌免疫中发挥核心作用。为促进肺内组织驻留相关表型T细胞的积累，多种异源疫苗接种策略被探索，其中prime-pull策略——即肠外接种疫苗后辅以黏膜抗原加强——是颇具前景的方法之一。

研究人员此前已证明，将iNKT细胞配体α-半乳糖神经酰胺（αGC）纳入mRNA-LNPs可拓宽先天性和适应性免疫，通过刺激iNKT细胞促进树突状细胞成熟，从而更有效地启动T细胞，最终改善细胞介导的免疫应答并提高抗体滴度。在预防性接种中，αGC佐剂化mRNA-LNPs在小鼠中显著改善了针对单核细胞增生李斯特菌的保护效果，在鹦鹉中针对鹦鹉热衣原体也取得了更好的临床结局。在结核病背景下，大量证据支持iNKT细胞在保护中的作用：将αGC与BCG或含Ag85B和ESAT-6抗原的舌下亚单位疫苗联合使用可改善细菌控制；在治疗情境中，αGC与异烟肼联合给药可进一步增强C3H/HeJ和C57BL/6小鼠的治疗效果。

基于上述证据，研究人员假设将αGC纳入针对结核病的mRNA-LNP制剂可增强其作为疫苗候选品的效用。本研究旨在系统表征αGC佐剂化mRNA-LNPs编码ESAT-6和Ag85B两种临床相关Mtb抗原后诱导的免疫应答，并评估其在prime-pull策略下促进肺组织驻留相关T细胞积累的潜力。

二、研究设计与关键方法

研究人员采用多种关键技术方法开展研究。首先通过体外转录制备编码截短卵清蛋白（OVA）、ESAT-6或Ag85B的mRNA，抗原序列两端分别偶联人LAMP1信号肽和人LAMP3跨膜结构域序列，以最大化CD8⁺和CD4⁺ T细胞应答。随后利用可电离脂质C12-200及辅助脂质制备mRNA-LNPs，佐剂化制剂额外纳入αGC。动物实验使用7周龄雌性C57BL/6或CB6F1/J小鼠（分别购自Envigo荷兰和Charles River Laboratories法国），采用肌内注射进行疫苗接种，部分实验在末次肌内免疫一周后通过鼻内滴注全长ESAT-6和Ag85B蛋白（购自BEI Resources）实施prime-pull加强。免疫学评估主要依赖流式细胞术，包括使用MHC四聚体（H-2Kb/SIINFEKL-OVA四聚体、I-A^b/ESAT-6和I-A^b/Ag85B四聚体、mCD1d PBS-57 iNKT四聚体）检测抗原特异性T细胞，通过肽库或全长蛋白再刺激后进行细胞内细胞因子染色评估T_H1/T_H2/T_H17应答，并使用LEGENDplex多重检测平台定量培养上清中12种细胞因子水平。ELISA用于检测抗体滴度。统计分析采用单因素或双因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验。

三、研究结果

3.1 αGC佐剂化mRNA-LNPs以剂量依赖方式激活iNKT细胞和抗原特异性CD8⁺ T细胞

研究人员首先以OVA为模型抗原，在C57BL/6小鼠中评估不同剂量（0.5、1、2.5、5 μg mRNA）αGC佐剂化mRNA-LNPs的免疫激活效应和反应原性。物理化学表征确认αGC共封装不改变颗粒大小、表面电荷或mRNA封装效率。接种后72小时，引流淋巴结（dLN）和脾脏中iNKT细胞频率在各剂量组间总体相当，但iNKT细胞上程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）的表达呈明确剂量依赖性升高，证实了iNKT细胞的剂量依赖性激活。体重监测显示疫苗接种引起剂量依赖性体重下降，最高剂量（5 μg）时相对体重减轻达10%，αGC纳入未显著加重体重减轻。初次免疫后两周加强免疫，再两周后评估OVA特异性CD8⁺ T细胞应答，结果显示CD8⁺ T细胞应答在2.5 μg剂量趋于平台期，且αGC佐剂化组个体间变异较小。基于免疫原性与耐受性的平衡，后续实验选择2.5 μg mRNA剂量。

3.2 αGC纳入mRNA-LNPs平衡CD4⁺ T_H1/T_H2应答并增强CD44⁺CD69⁺CD62L^- CD4⁺ T细胞的生成

在C57BL/6小鼠中，研究人员采用编码ESAT-6和Ag85B（1:1重量比）的mRNA-LNPs进行初次-加强免疫。通过I-A^b四聚体检测，dLN中未佐剂组可清晰识别抗原特异性CD44⁺ CD4⁺ T细胞，而αGC佐剂组比例较低；脾脏中ESAT-6特异性CD4⁺ T细胞在两种制剂中诱导水平相当。值得注意的是，αGC纳入显著增加了脾脏中CD44⁺CD69⁺CD62L^- CD4⁺ T细胞的比例（针对ESAT-6和Ag85B均如此），且这些细胞大部分为KLRG1阴性。肽库再刺激分析显示，两种制剂均诱导了相当的T_H1细胞因子（IFN-γ和TNF-α）产生，但αGC组IL-2产生CD4⁺ T细胞水平较低，导致多功能性T_H1细胞（IFN-γ、TNF-α和IL-2三阳性）在未佐剂组中更高。αGC佐剂化mRNA-LNPs诱导了可检测的T_H2应答（IL-4产生细胞）和针对Ag85B的T_H17应答，且IL-17A和IFN-γ双阳性CD4⁺ T细胞比例显著增加。全长蛋白再刺激后上清细胞因子检测进一步证实了这些趋势，αGC组检测到IL-5（针对两种抗原）和IL-13（针对ESAT-6）分泌，支持αGC促进更平衡的T_H1/T_H2谱型。在C57BL/6模型中未检测到针对ESAT-6或Ag85B的CD8⁺ T细胞应答。

3.3 杂交CB6F1小鼠同时展现抗原特异性CD4⁺和CD8⁺ T细胞应答，并确认αGC相关的T_H2细胞因子产生

鉴于文献报道Ag85B存在H-2^d MHC-I单倍型限制性表位（在BALB/c小鼠中表达），研究人员在同时具有H-2^b和H-2^d MHC-I单倍型的杂交CB6F1小鼠中开展了平行实验。在该模型中，研究人员确实检测到了针对ESAT-6和Ag85B的CD8⁺ T细胞应答，但αGC的影响因抗原而异：对ESAT-6，αGC纳入增加了CD8⁺ T细胞应答；对Ag85B，则呈降低趋势。在CD4⁺ T细胞应答方面，αGC纳入对T_H1和T_H17应答（单细胞因子及多功能性水平）均无可检测影响，这与C57BL/6小鼠中观察到的明显差异形成对比，提示遗传背景影响对疫苗介导免疫调节的响应性。然而，αGC纳入确实诱导了针对ESAT-6的IL-4产生CD4⁺ T_H2细胞，确认了αGC相关的T_H2偏向效应。全长蛋白再刺激后，CB6F1小鼠的绝对细胞因子浓度高于C57BL/6小鼠，尤其是Ag85B再刺激后的IFN-γ水平，提示杂交小鼠中T细胞激活更为显著。

3.4 αGC纳入和局部蛋白加强增加肺相关抗原特异性CD4⁺ T细胞中携带T_RM相关表型的细胞频率

在CB6F1小鼠中，研究人员实施了prime-pull策略：肌内初次-加强接种mRNA-LNPs（含或不含αGC），一周后部分小鼠接受鼻内全长ESAT-6和Ag85B蛋白滴注作为pull刺激。四聚体染色显示，αGC纳入显著增加了脾脏中Ag85B特异性CD4⁺ T细胞频率，对ESAT-6呈类似但未达显著的趋势。鼻内蛋白加强后，脾脏中抗原特异性CD4⁺ T细胞频率显著下降，而肺中ESAT-6和Ag85B特异性CD4⁺ T细胞数量显著增加（四聚体染色和肽库再刺激两种方法均证实），最高应答出现在αGC佐剂化组。对肺中CD69⁺CD62L^-KLRG1^-抗原特异性细胞的进一步分析显示，pull刺激和αGC佐剂化均增加了该细胞群的频率。针对肺相关CD4⁺ T细胞中表达CD69、缺乏CD62L和KLRG1、共表达PD-1和CXCR3的表型（该表型与组织驻留相关和肺局部化T细胞表型相关），研究发现该效应主要由鼻内加强驱动，但析因统计分析鉴定出αGC佐剂化对Ag85B存在显著交互效应，提示αGC对该应答具有额外贡献。

四、讨论与结论

研究讨论指出，αGC佐剂化mRNA-LNPs诱导的iNKT细胞剂量依赖性激活可能直接贡献于抗Mtb保护，因为iNKT细胞具有杀菌活性，与小鼠Mtb感染期间细菌控制的改善相关。活动性结核病患者外周血iNKT细胞频率低于潜伏感染者，支持其在宿主防御中的作用。αGC介导的iNKT激活还可旁观者激活其他与Mtb控制相关的效应细胞，如NK细胞和γδ T细胞。基于免疫原性与耐受性的平衡，2.5 μg mRNA剂量被选定为最优剂量。

关于T辅助细胞谱型，传统结核病疫苗开发聚焦于诱导高频率T_H1 IFN-γ产生T细胞，但新兴证据表明需要更广泛和多层面的免疫应答来应对Mtb的复杂生物学。MVA85A疫苗候选品在BCG免疫婴儿的2b期试验中未能提供保护，尽管临床前研究诱导了强效多功能性T_H1应答，这凸显了超越经典T_H1免疫的重要性。αGC纳入后观察到的T_H2和T_H17应答的出现与iNKT细胞激活后早期共产生IFN-γ和IL-4的特征一致。T_H17细胞与Mtb早期保护增强相关，且IFN-γ和IL-17A双阳性CD4⁺ T细胞与单纯IFN-γ⁺ CD4⁺ T细胞相比与更优细菌控制相关。尽管多功能性T_H1细胞通常与有效控制结核感染相关，αGC导致的T_H2偏向可能看似不利，但αGC佐剂化引发的其他效应能否补偿甚至超越这一潜在保护相关指标的降低，仍需未来Mtb攻毒实验来确定整体保护效力。

CB6F1小鼠实验揭示了遗传背景对疫苗诱导免疫的影响。αGC对ESAT-6和Ag85B CD8⁺ T细胞应答的差异效应可能源于H-2^d限制性表位加工或MHC-I结合亲和力的差异、抗原表达或稳定性的差异、抗原固有免疫刺激特性的差异或交叉提呈途径的竞争。ESAT-6已被报道可直接与TLR2信号相互作用，可能干扰佐剂介导的效应。

关于肺组织驻留记忆T细胞，由于Mtb主要感染肺部，T_RM细胞及携带T_RM相关特征的T细胞的局部诱导被认为是保护性免疫的关键要素。T_RM细胞在病原体遭遇时快速而强效扩增，在小鼠和非人灵长类中充当抵御Mtb感染的第一道防线。常规mRNA-LNPs诱导肺内T_RM样表型细胞的能力有限，而αGC纳入显著增加了脾脏中CD44⁺CD69⁺CD62L^-CD4⁺ T细胞数量，与Ganley等在疟疾模型中针对CD8⁺ T细胞的报道一致，该研究将iNKT细胞产生的IL-4鉴定为此效应的关键驱动因素。prime-pull策略中，鼻内蛋白加强显著增加了肺内抗原特异性CD4⁺ T细胞频率，αGC可能通过增加疫苗诱导的抗原经历型T细胞池来促进黏膜抗原暴露后在肺中的积累。肺内高比例细胞表达CXCR3、PD-1和CD69而缺乏KLRG1和CD62L，指示激活的、非终末分化的、具有向肺感染部位迁移能力并可能发挥强效效应功能的表型。类似表型此前已与Mtb感染保护相关联，过继转移至 na?ve 小鼠可赋予保护。

研究局限性包括：未进行Mtb攻毒实验，无法确定这些应答是否转化为对感染或疾病的增强保护；未使用血管内标记和CD103、CD49a等肺驻留标志物，所描述群体应解释为具有组织驻留相关表型特征的T细胞而非真正的T_RM细胞；所有实验使用雌性小鼠，无法评估性别依赖性差异；prime-pull策略仅在CB6F1/J小鼠中评估，无法评估品系依赖性差异。

研究结论：αGC可以重编程mRNA-LNP诱导的免疫，通过改变T_H1/T_H2应答、促进T_H17介导免疫以及促进肺中携带组织驻留相关表型特征的T细胞积累。利用Mtb抗原ESAT-6和Ag85B，研究人员证明了广泛细胞免疫应答的诱导，支持该疫苗平台在保护性攻毒研究中的进一步评估。