PBMC处理、冷冻保存及细胞培养中省略血清对临床ELISpot检测性能的影响：T细胞活力、功能与阶段特异性培养基策略

《AAPS Open》：Effects of serum omission during PBMC processing, cryopreservation, and cell culture on clinical ELISpot assay performance

血清常被用作冷冻保存培养基（cryopreservation media）、洗涤缓冲液（wash buffers）和细胞培养基（cell culture medium）的添加剂。由于不同批次血清（serum lots）性能可变，无血清替代品（serum-free variants）是理想的替代选择。本研究论文探讨在开展临床酶联免疫斑点（ELISpot）实验的背景下，从洗涤缓冲液、冷冻培养基（cryomedium）或细胞培养基中省略血清对T细胞活力与功能的影响。尽管无血清培养基在ELISpot实验中表现出与含血清培养基相当的实验性能，但省略血清对延迟样本处理后的外周血单个核细胞（PBMC）功能的影响尚不清楚。此外，尽管无血清冷冻培养基在PBMC中显示出与含血清冷冻保存培养基相当、经ELISpot实验测定的活力和γ干扰素（IFN-γ）分泌，但省略血清对液氮长期储存后PBMC功能的影响仍不清楚。研究发现，在PBMC分离过程中向洗涤缓冲液中加入牛血清白蛋白（BSA）可提高总体PBMC细胞产量。此外，含胎牛血清（FBS）的细胞培养基可降低实验背景，尤其是在PBMC分离延迟时。而且，研究人员发现，在PBMC冷冻保存中省略血清对T细胞活力和T细胞功能影响极小，即使在液氮中储存2年后也是如此。总之，这些发现为临床ELISpot研究选取合适培养基、优化和改进临床操作流程以及样本处理和运输方面的合规性提供了策略。

论文解读：PBMC处理、冷冻保存及细胞培养中省略血清对临床ELISpot检测性能的影响

研究背景与问题。酶联免疫斑点（ELISpot）是一种广泛用于检测抗原刺激后分泌细胞因子或抗体的特定免疫细胞频率的方法，因灵敏度高和实验设置相对直接，已成为临床前和临床研究中细胞免疫原性反应研究的优选标准方法。然而，从血液采集到外周血单个核细胞（PBMC）分离的处理延迟仍是临床研究中的主要物流挑战。通常建议血液采集后8 h内处理为PBMC并冷冻保存，以准确测定T细胞功能，但临床站点常因缺乏合适实验室设备和训练有素人员而出现1–2天延迟，尤其在大规模多中心研究中，样本需陆运或空运至不同地理位置的样本处理实验室，因此运输稳定性评估十分重要。延迟处理的PBMC仍可表现抗原反应性，但针对新鲜分离PBMC优化的方法未必适用于延迟处理PBMC。传统上，血清及其衍生物如牛血清白蛋白（BSA）和胎牛血清（FBS）被加入实验缓冲液，为PBMC提供营养和生长因子，但血清批次性能可变，有的批次增强T细胞反应，有的抑制反应，且合格化和桥接新批次需时间和资源。无血清培养基如AIM-V^TM和X-VIVO^? 15被开发用于模拟血清的生理特性；既往研究显示无血清培养基在支持PBMC活力和IFN-γ分泌方面与含血清培养基同样有效，但这些研究中PBMC在8 h处理窗口内及时采集。省略血清对全血处理、PBMC分离/储存和实验设置的影响仍不明确，尤其在临床研究中样本常因运输而从临床站点到处理实验室发生延迟处理。类似地，无血清冷冻保存培养基如CryoStor^? CS10被开发为含FBS冷冻保存培养基的替代品；大型多中心研究报道无血清冷冻培养基在支持细胞活力和ELISpot实验性能方面与含血清冷冻保存培养基同样有效，但该研究中PBMC在24 h内分离和冷冻，液氮气相储存时间未指定，运输后样本在?80 °C冰箱储存2–12周后分析。临床ELISpot研究中细胞通常长期储存于液氮（LN₂），省略血清对长期储存PBMC功能的影响不清楚。因此，研究人员开展研究，评估临床ELISpot工作流程中多个步骤省略血清的影响，包括从全血分离PBMC时的样本洗涤、冷冻保存和细胞培养，以寻找一致且稳健的PBMC样本采集和储存条件，并为临床研究中选择合适培养基、优化整体ELISpot方法性能和合规性提供依据。

关键技术方法概述。研究参与者来自美国Spring House PA的Johnson & Johnson Innovative Medicine，提供书面知情同意，临床方案经机构审查委员会批准。研究人员将个体人血采集至含肝素抗凝剂的Vacutainer^TM管，采用SepMate^TM管和Ficoll密度梯度离心分离PBMC，并以不同洗涤缓冲液处理，包括杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）、DPBS＋0.5% BSA、DPBS＋0.5%人血清白蛋白（HSA）、DPBS＋0.5%重组人血清白蛋白（rHSA）或DPBS＋2% FBS，部分样本进行32 h或52 h延迟处理。细胞冷冻后经CoolCell转入?70 °C，再转液氮长期储存；复苏后在AIM-V、RPMI＋FBS或AIM-V＋AlbuMAX^TM中培养，以CEFX肽池（CEFX peptide pool）刺激，采用IFN-γ ELISpot检测，IRIS2读板；统计采用Prism 10，两组比较采用双尾配对t检验或Mann-Whitney U检验。

研究结果。第一，PBMC分离洗涤缓冲液中含FBS劣于含BSA或rHSA的缓冲液。研究人员从4名供体采血并进行次日32 h处理延迟，比较PBS、PBS＋0.5% BSA和PBS＋2% FBS，发现BSA或FBS对冷冻前活力无影响，但PBS＋0.5% BSA使PBMC产量增加约90%，PBS＋2% FBS增加约40%，三者对ELISpot阴性或阳性对照性能无差异。进一步比较PBS、PBS＋0.5% BSA和PBS＋0.5% HSA，发现BSA和HSA均使细胞活力提高约15%、PBMC产量提高约100%，但HSA强烈增加实验背景，表明HSA成分干扰下游实验性能。再比较PBS、PBS＋0.5% BSA和PBS＋0.5% rHSA，发现BSA和rHSA均使PBMC产量增加约50%，且均不影响ELISpot性能。结论为BSA或rHSA可作为洗涤缓冲液关键成分提高PBMC产量，而常规HSA不应用于ELISpot的PBMC分离洗涤缓冲液。

第二，无血清冷冻培养基CS10在PBMC样品液氮储存至少2年时提供与含血清冷冻培养基相当的细胞活力和IFN-γ ELISpot性能。研究人员从5名供体8 h内分离PBMC，分别用无血清CS10或含血清FBS10冷冻，在液氮中储存2周、3个月、6个月、12个月和24个月后检测。结果显示，两种冷冻培养基在储存至24个月时均维持PBMC活力＞95%，且CS10在CEFX刺激后的IFN-γ分泌ELISpot检测中表现相当。结论为PBMC活力和功能至少维持2年液氮储存，无血清CS10与含血清FBS10在细胞活力和IFN-γ ELISpot性能方面质量相似。

第三，含预筛FBS的培养基改善复苏后PBMC回收，相比无血清培养基，并似乎降低IFN-γ ELISpot实验背景。研究人员从4名供体4 h内用DPBS＋0.5% BSA分离PBMC并以CS10冷冻，复苏后在含FBS的RPMI＋FBS或无血清AIM-V中培养。结果发现，无血清复苏培养基未显著影响复苏后活力，但无血清培养基使复苏后细胞回收显著降低约20%；使用含血清细胞复苏和培养培养基时ELISpot实验背景较低，而对阳性对照CEFX的反应与AIM-V相似。结论为含预筛FBS培养基可改善复苏后PBMC回收并降低背景。

第四，血清成分或含血清培养基均不能恢复延迟PBMC分离所观察到的IFN-γ ELISpot反应丧失。研究人员比较供体匹配PBMC在4 h内或延迟52 h分离，分别培养于无血清AIM-V、AIM-V＋AlbuMAX^TM（BSA）或自配RPMI＋FBS。结果显示，4 h内新鲜处理样本中三种培养基的ELISpot性能无差异；但在显著延迟处理样本中，4名供体有2名在AIM-V或AIM-V＋BSA中实验背景增加约10倍，而含血清RPMI＋FBS未出现背景升高。同一供体4 h与52 h比较显示，显著延迟导致PBMC功能下降，且添加血清不能挽救。结论为AIM-V对新鲜PBMC提供与含血清培养基相当的质量，但延迟处理时与AIM-V相关的ELISpot背景增加值得注意。

讨论与结论。研究人员全面评估了从PBMC分离/储存、细胞活力、功能到实验性能的临床ELISpot方法工作流程中省略血清的影响。血清提供生长因子、激素和营养，可增强细胞活力和功能，并营造更接近生理条件的环境，但临床ELISpot研究要求一致和可重复结果，血清批次组成变异可导致T细胞免疫反应增强或抑制差异，并引入非特异背景信号，且使用血清常需预测试或桥接，增加时间和资源消耗。PBS常用于PBMC分离中的血液稀释和洗涤；对于过夜延迟处理PBMC，向PBS中加入BSA或rHSA可改善回收并保持PBMC产量，产量挽救幅度约50–100%，这在血容量有限且需要最低细胞输入以获得可靠读数的临床ELISpot研究中尤为重要。血浆来源HSA在洗涤缓冲液中增加ELISpot背景，因此与ELISpot工作流程不相容；rHSA可作为实用且更定义化的替代品支持产量而不损害实验性能。无血清培养基如AIM-V和X-VIVO 15因有助于可重复性和符合化学限定培养系统的监管期望而受关注；本研究中AIM-V在最佳处理条件下与含血清培养基在支持PBMC活力和ELISpot读数方面相当，但省略血清可能导致ELISpot背景增加，尤其在处理延迟或样本处理欠佳时。另一项研究也注意到AIM-V用于ELISpot时背景升高，并推测与凋亡相关；不同血清批次可导致不同水平非特异背景，因此建议预筛血清批次。研究人员此前优化了PBMC样本处理参数，使4 h内新鲜采集样本与最长32 h采集样本的ELISpot性能相当；还尝试粒细胞去除/失活、抗氧化剂和低温储存等方法将处理窗口延长至52 h，但均不能挽救52 h处理导致的功能丧失；本报告中添加血清也不能恢复52 h处理PBMC的功能。进一步研究需要延长PBMC稳定性超过32 h。

研究结论部分翻译：总之，尽管无血清培养基在标准化、降低变异性和监管合规方面具有显著优势，但在样本处理时间和研究要求的背景下，其使用应被仔细考虑。研究人员的发现支持在样本及时处理时，将无血清培养基用于PBMC处理和ELISpot实验。然而，对于预计存在处理延迟的临床研究，推荐采用阶段特异性策略：在PBMC分离洗涤缓冲液中补充BSA或rHSA以提高细胞产量；使用无血清冷冻保存培养基如CS10，其在长期液氮储存期间维持PBMC活力和ELISpot性能；使用含预筛、合格FBS批次的培养基以改善复苏后回收并降低非特异ELISpot背景。这些措施可减轻延迟处理的某些影响，但不能恢复52小时延迟后丧失的抗原特异性反应。因此，处理窗口、试剂批次和阶段特异性培养基应针对预期多中心临床工作流程进行预定义和合格化。总之，研究人员为延迟PBMC样本处理提供了建议。这些见解强调根据采用ELISpot方法的免疫监测研究的具体物流和实验背景定制培养基选择的重要性，研究人员的发现可从改进科学和临床合规角度为优化从样本采集、储存到实验性能的整体“端到端”ELISpot方法流程提供关键指导。